李志群 張 豐 祝 揚(yáng) 趙景民 潘 登 楊建法 趙雨來(lái)

慢性乙型肝炎（CHB）患者肝組織可出現(xiàn)不同程度的微循環(huán)障礙。迄今為止，有關(guān)CHB肝內(nèi)微循環(huán)障礙的分子機(jī)制尚未明確。為此，我們選擇CHB和肝硬化患者的穿刺肝組織，進(jìn)行α-SMA、環(huán)氧化酶（COX1）、COX2、AngII及 AT1 蛋白分子的表達(dá)狀況研究，以探討其與肝內(nèi)微循環(huán)障礙發(fā)生的關(guān)系。

材料與方法

一、材料來(lái)源 選取2000年～2004年期間解放軍302醫(yī)院收治的經(jīng)臨床和病理診斷的慢性乙型肝炎和肝硬化患者肝穿刺標(biāo)本120例，排除合并其他病毒感染者。肝穿活組織經(jīng)10%甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。以肝移植健康供肝肝組織標(biāo)本作為對(duì)照組（n=10）。

二、主要試劑 鼠抗人α-SMA、鼠抗人COX1、鼠抗人COX2和EliVisionTM System檢測(cè)試劑盒為Dako公司產(chǎn)品，DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司；兔抗人血管緊張素II（AngII）I型受體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

三、免疫組織化學(xué)檢測(cè) 主要步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2-蒸餾水37℃孵箱去除內(nèi)源酶;以抗原熱修復(fù)法進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波爐煮沸持續(xù)15min；室溫自然冷卻;PBS沖洗5min×3次，分別滴加兔抗人AT1單克隆抗體（稀釋濃度1：100）、鼠抗人α-SMA單克隆抗體（稀釋濃度1：150）、鼠抗人COX1單克隆抗體（稀釋濃度1：150）、鼠抗人COX2單克隆抗體（稀釋濃度 1：100），4℃冰箱過(guò)夜；PBS 沖洗 5min×3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記二抗，室溫40min；PBS沖洗 5min×3次；DAB 顯色；蘇木素襯染細(xì)胞核、封片。陽(yáng)性染色呈棕黃色。磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞在CHB患者肝組織內(nèi)的分布，每張切片選取5個(gè)以上典型匯管區(qū)和肝小葉，于200倍視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

四、病理形態(tài)學(xué)觀察 常規(guī)HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行單向有序的R×C表的logistic回歸分析。

結(jié) 果

一、肝組織α-SMA的表達(dá) 肝小葉內(nèi)竇周纖維化區(qū)域、纖維增生明顯，匯管區(qū)內(nèi)及其小血管周圍、血竇壁及邊緣區(qū)可見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)。在S4期肝組織內(nèi)，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔內(nèi)及周圍竇壁細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖1）。

圖1 S4期肝組織α-SMA的表達(dá) 小血管周圍呈強(qiáng)陽(yáng)性（EliVisionTM System 法，×200）

二、肝組織COX1的表達(dá) COX1蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿，在S3期肝組織，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，殘留的匯管區(qū)、肝細(xì)胞及竇壁細(xì)胞COX1呈高表達(dá)，纖維間隔周圍部分少數(shù)炎細(xì)胞也有表達(dá)（圖2）。

圖2 S3期肝組織COX1的表達(dá) 肝細(xì)胞漿呈高表達(dá)（EliVisionTM System 法，×100）

三、肝組織COX2的表達(dá) COX2蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿，在S2期肝組織內(nèi)殘留的匯管區(qū)及纖維間隔周邊部的間質(zhì)細(xì)胞、炎細(xì)胞內(nèi)COX2呈高表達(dá)，周圍肝細(xì)胞、竇壁細(xì)胞呈弱表達(dá)（圖3）。

圖3 S2期肝組織COX2的表達(dá) 在間質(zhì)細(xì)胞和炎細(xì)胞內(nèi)COX2呈高表達(dá)（EliVisionTM System 法，×200）

四、肝組織AngII的表達(dá)血管緊張素II（AngII）在纖維間隔內(nèi)及部分間質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在硬化結(jié)節(jié)的竇壁細(xì)胞及部分肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)。小血管壁內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)（圖4）。

圖4 活動(dòng)期肝硬化肝組織AngII的表達(dá) 在纖維間隔內(nèi)及部分間質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（EliVisionTM System法，×100）

五、肝組織AT1的表達(dá) 在肝硬化肝組織纖維間隔周邊部肝細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，AT1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖 5）。

圖5 肝硬化肝組織AT1的表達(dá) 染色陽(yáng)性產(chǎn)物定位于肝細(xì)胞質(zhì)（EliVisionTM System 法，×100）

討 論

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（SEC）含有收縮調(diào)節(jié)蛋白（α-肌動(dòng)蛋白），肝竇直徑的生理調(diào)節(jié)由肝星狀細(xì)胞（HSC）控制。在竇狀隙周圍激活的肝星狀細(xì)胞表達(dá)α-SMA，并導(dǎo)致竇狀隙周圍肝纖維化的發(fā)展。肝損傷后肝星狀細(xì)胞激活的最突出特征是調(diào)節(jié)竇周血管收縮力顯著增強(qiáng)，致使肝臟血管排列紊亂，使門(mén)脈高壓的肝臟內(nèi)阻力增加[1～3]。

本研究顯示，在肝纖維化的肝組織中α-SMA呈強(qiáng)陽(yáng)性，α-SMA陽(yáng)性平滑肌細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞散在分布于小血管周圍、邊緣區(qū)，較健康對(duì)照肝組織數(shù)目有所增加。

COX有兩種同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型表達(dá)，COX-2為誘生型表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞及竇壁細(xì)胞COX-1呈高表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，COX-2是惡性轉(zhuǎn)化的早期標(biāo)志[5]。最近報(bào)道，COX-2在HCC病人中有過(guò)表達(dá)，選擇性COX-2抑制物有利于惡性腫瘤的治療[6]。對(duì)門(mén)脈高壓小鼠小劑量阿司匹林有抑制血小板活性作用，是通過(guò)COX2途徑而不是COX1途徑[7]。在脂肪肝、炎癥和壞死病理改變的肝組織中，促炎性調(diào)解蛋白COX-2mRNA表達(dá)水平顯著增加，與壞死性炎的改變相一致[4]。COX-2是肝臟炎癥和纖維化形成的關(guān)鍵作用因子[8，9]。

人和大鼠HSC均表達(dá)AT1，并且外源性AngII能刺激其收縮和增殖[10]。肝臟局部存在由HSC合成和分泌的RAAS，它作用于自身AT1R受體，促進(jìn)HSC增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎和肝硬化活檢肝組織內(nèi)α-SMA、COX2、AngII及 AT1 表達(dá)水平明顯上調(diào)。α-SMA、COX2、AngII、AT1 在慢性乙型肝炎及肝硬化肝臟微循環(huán)障礙的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

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