亢 涵，李 楠，任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱150090，rnq@hit.edu.cn)

強化生物除磷(EBPR)技術利用微生物高效去除污水中的磷酸鹽，已經廣泛應用于污水處理廠中.聚磷菌和聚糖菌是存在于強化生物除磷系統(tǒng)(EBPR)中的競爭菌.聚磷菌在厭氧階段分解體內 polyP釋放能量來吸收底物合成體內的PHAs儲備，在好氧階段分解體內的PHAs，釋放能量吸收磷酸鹽合成體內polyP［1］.聚糖菌與聚磷菌不同之處在于，厭氧階段分解體內糖原釋放能量，用來吸收底物合成PHAs，在好氧階段分解體內的PHAs釋放能量合成糖原［2］.為了讓反應器取得更好的除磷效果，前人研究了EBPR系統(tǒng)的影響因素.Zhang等發(fā)現當 pH從7.0降到6.5時，反應器除磷能力降低［3］.Serafim等發(fā)現當pH從7.0增加到8.5時，反應器的除磷能力增加［4］. Oehmen等認為丙酸比乙酸有利于提高EBPR系統(tǒng)的除磷效果，因為聚糖菌吸收丙酸速率小于聚磷菌［5］.Panswad等發(fā)現，溫度從20℃升到35℃時厭氧釋磷速率增加，但好養(yǎng)磷吸收速率降低，即使在20℃，反應器中仍存在大量聚糖菌［6］.溶解氧(DO)也影響聚磷菌和聚糖菌的競爭［7］.

本研究在低溫下運行了強化生物除磷反應器，利用FISH技術監(jiān)測其中的聚磷菌和聚糖菌并將它們量化，研究其競爭關系及其對反應器除磷效果的影響.

1 實驗

1.1 實驗裝置與方法

試驗采用有效容積為2 L的圓柱形有機玻璃反應器，內徑為10 cm，高度為35 cm.反應器間歇式運行，12 h一個周期.0～90 min厭氧攪拌(其中0～8 min進水)，90～330 min好氧曝氣，沉降15 min，出水10 min，閑置5 min.溫度與DO用WTW DO測定儀監(jiān)測，控制反應器內溫度在(15± 2)℃，好氧階段溶解氧質量濃度>2.0 mg·L-1.

1.2 實驗材料

接種污泥取自哈爾濱文昌污水處理廠曝氣池，該污水廠采用傳統(tǒng)活性污泥法，污泥具有良好的有機物去除效果，除磷效率<30%.

實驗用水采用人工配水，進水的主要組成物質與濃度為 CH3COONa·3H2O 4.69 mmol/L (COD為300 mg·L-1)，NH4Cl 1.79 mmol/L(ρN= 25 mg·L-1)，NaH2PO4·2H2O 0.32 mmol/L(ρP= 10 mg·L-1)，此外每升進水中含有0.5 mL微量元素液:EDTA 100 mg·L-1，MgSO4·7H2O 20.6 g·L-1，CaCl25.6 g·L-1，MnSO4·H2O 0.14 g·L-1，FeSO4·7H2O 5.7 g·L-1，CuCl2·2H2O 0.19 mg·L-1，ZnCl20.05 g·L-1，H3BO30.05 g·L-1.

1.3 取樣與水質分析方法

為了考察反應器啟動過程中聚磷菌的形態(tài)與數量以及與污染物處理效果的關系，分別在反應器運行第0，10，20，30，40，50，60 d取樣.取樣后離心分離混合液，上清液過濾后按照《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第三版)檢測COD，PO4

3-等水質指標，污泥部分立即固定用于FISH分析.

1.4 FISH分析

1.4.1 樣品的固定

污泥樣品在質量分數為4%多聚甲醛中4℃固定2 h，在PBS溶液中沖洗2次，懸浮于PBS-乙醇(體積比1∶1)溶液中，于-20℃保存.

1.4.2 熒光探針

實驗應用16S rRNA探針如表1所示.

表1 實驗應用的16S rRNA探針

1.4.3 原位雜交

將固定的樣品置于用明膠包背的載玻片上，風干后于體積分數分別為50%，80%，95%，100%的乙醇中各脫水3 min，風干后等待雜交.污泥樣品在46℃雜交2.5 h，雜交液成分如下:0.9 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，質量分數為 0.01% SDS，體積分數為20%(EUB388)和體積分數為35%(PAOmix、DFmix、GAOsmix)去離子甲酰胺，pH 7.2.雜交后于48℃用洗液(40 mmol/L NaCl，質量分數為0.01%SDS，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2)洗20 min，之后用蒸餾水洗去殘留洗液，自然風干［12］.風干后樣品用共聚焦顯微鏡 LSM 510 META(德國Zeiss公司)觀察，并用其配套軟件獲得聚磷菌數量在全菌數量中所占比例.

2 結果與分析

2.1 COD去除效果

圖1給出了反應器COD去除效果.由圖可見，在反應器運行的60 d中，COD去除率平穩(wěn)，保持在95%左右.大部分COD在厭氧階段去除.0～20 d厭氧末期COD濃度變化較大，20 d之后趨于平穩(wěn).

圖1 反應器COD的去除情況

2.2 磷酸鹽去除效果

圖2給出了低溫運行的反應器中磷的去除效果.由圖可見，初期磷酸鹽去除率不穩(wěn)定，20 d后，出水磷濃度逐漸降低，使磷酸鹽去除率持續(xù)上升，60 d時達到最大值86.89%.初期厭氧末期磷濃度波動較大，20 d后逐漸增加，45 d時達到最大值26.44 mg·L-1.50 d時突然降低，之后又再次升高.

圖2 反應器磷酸鹽的去除情況

2.3 FISH原位檢測反應器中聚糖菌

圖3分別為反應器中聚磷菌和聚糖菌的雙雜交FISH圖片.圖3(a)為反應器運行50 d時反應器中的聚磷菌FISH圖片.這張圖片中用到的雜交探針為FITC染料標記的EUB338mix探針和CY3染料標記的PAOmix探針，圖中的黃色熒光為雜交了這兩中探針的Rhodocyclus sp.，綠色熒光為只雜交了EUB338mix探針的菌.圖3(b)為反應器運行10 d時反應器中的聚糖菌FISH圖片.這張圖片中用到的雜交探針為FITC染料標記的EUB338mix探針、CY3染料標記的PAOmix探針和CY5染料標記的DFmix探針.圖中圓箭頭標記的紅色熒光為雜交了GAOmix探針的Competibacter phosphatis(Gammaproteobacteria)，標準箭頭標記的藍色熒光為雜交了DFmix探針的Defluviicoccus spp.(Alphaproteobacteria)，綠色為雜交了EUB338mix探針的菌.

圖3 反應器中聚磷菌和聚糖菌的FISH圖片

2.4 聚糖菌含量

利用共聚焦顯微鏡配套軟件，可獲得聚磷菌在全菌中所占的數量比例(圖4).由圖可見，聚磷菌在全菌中的數量比例逐漸上升.30 d之前聚磷菌增長較快，數量從19.96%增加到33.13%. 30～50 d聚磷菌數量保持在33%左右，60 d時聚磷菌數量突然增加，達到最大值41.49%.0～30 d反應器中的Alphaproteobacteria數量占全菌數量的比例由15.76%下降到3.1%，30～60 d保持在2.6%左右.Gammaproteobacteria數量逐漸上升，但在全菌數量中所占比例不高，最高為8.11%.

圖4 污泥中聚磷菌和聚糖菌占全菌的數量比例

3 討論

圖4(a)為聚磷菌50 d時的照片.此時反應器的除磷率為75%.圖中聚磷菌菌體密集成團，菌群面積較大.圖5中，此時聚磷菌占全菌的數量比例為35.1%，為0～50 d的最大值.圖4(b)為聚糖菌10 d時的照片.圖中藍色為Alphaproteobacteria，此時反應器中Alphaproteobacteria數量較多，占全菌數量的14.24%，菌體呈現明顯的四聚體(TFOs)形態(tài)，且在污泥中分散存在.圖中紅色為Gammaproteobacteria，Gammaproteobacteria菌體為大球型，數量較少.

聚糖菌是強化生物除磷反應器中聚磷菌的競爭菌.由圖5可以看出，0 d時Alphaproteobacteria的數量較多，達到了15.76%，與聚磷菌的數量19.96%比較接近，Gammaproteobacteria數量很少，為2.49%.低溫運行了20 d后，聚磷菌的數量不斷增加，Alphaproteobacteria的數量不斷降低，而Gammaproteobacteria的數量在反應器運行期間一直保持增加，但是占全菌數量的比例較少，最高為8.11%.Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria都是聚磷菌的競爭菌，但Alphaproteobacteria的數量卻不斷下降，而Gammaproteobacteria的數量雖然較少，但仍保持增長.這種現象可以解釋為，低溫條件下聚磷菌更易獲得足夠底物合成體內PHA用于生長繁殖;而Alphaproteobacteria在低溫下吸收底物合成PHA的速率降低，導致其數量的減少;對于Gammaproteobacteria，一方面受到低溫影響，一方面受到聚磷菌的數量優(yōu)勢的制約，其數量較少且增加緩慢.這與 Erdal等［13］和 Lopez-Vazquez［14］發(fā)現的現象相一致.

觀察圖2和3發(fā)現，與20 d以后的數據相比，20 d之前反應器的各項指標均不穩(wěn)定，這時是聚磷菌占據優(yōu)勢地位而聚糖菌逐漸被淘汰的調整階段.20～50 d，聚磷菌增長減緩，數量保持在33%左右，沒有了競爭菌的干擾，聚磷菌的除磷能力在逐漸增加.此時COD去除效果穩(wěn)定，磷酸鹽去除率持續(xù)上升，厭氧末期磷濃度在30 d之后保持穩(wěn)定，這與聚磷菌含量曲線相一致.這種現象說明，聚磷菌的數量決定了厭氧末期磷釋放量.

觀察50～60 d的厭氧末期磷濃度可以發(fā)現，50 d時雖然聚磷菌占全菌數量的比例沒變，但厭氧磷釋放減少，50 d后，隨著聚磷菌數量突然增加，厭氧磷釋放再次恢復，而整個過程中，COD去除率和厭氧末期COD濃度保持穩(wěn)定.這種現象可解釋為聚磷菌為了繁殖積累體內的磷儲備，而減少厭氧釋磷量.亢涵等曾發(fā)現，在反應器啟動階段，快速增殖的新生聚磷菌不能立刻行使除磷能力，要有一段“積累期”，形成 PHA和 polyP儲備［15］.而在本文的實驗中，聚磷菌快速增殖之后的反應器處理效果并沒有滯后.觀察亢涵等的聚磷菌數量比例曲線可以發(fā)現，聚磷菌的兩個增殖階段的菌體數量增長迅速，比如第一增殖階段聚磷菌占全菌數量比例在5 d內增加了23.59%.短時間內的大量增殖需要大量的PHA和polyP供給，因此出現了反應器除磷效果延后的現象.在本文的實驗中，50～60 d聚磷菌占全菌數量比例在5 d內平均增加了3.2%，數量較少，對反應器的處理效果沒有造成影響.

4 結論

1)強化生物除磷SBR反應器在低溫下運行了60 d.0～20 d反應器的各項指標不穩(wěn)定，這時反應器中的菌群結構發(fā)生變化，聚磷菌和聚糖菌競爭優(yōu)勢地位.此階段為反應器的調整階段，20 d后反應器各項指標逐漸穩(wěn)定，磷去除率增加.

2)在低溫運行的反應器中，0～20 d，低溫更有利于聚磷菌的生長繁殖，Alphaproteobacteria被淘汰.而Gammaproteobacteria受到溫度與聚磷菌的制約，占全菌數量比例最高為8.11%.

3)50～60 d聚磷菌出現了一個快速增殖階段，此時反應器的處理效果沒有出現亢涵等所說的延遲現象.亢涵等的實驗結果中，聚磷菌在短時間內大量增殖，聚磷菌占全菌數量比例5 d內增加了23.59%，PHA和polyP供給不足，導致反應器處理效果延后.本文的實驗中，聚磷菌數量5 d內平均增加了3.2%，沒有影響反應器的處理效果.

［1］MINO T，LIU W T，KURISU F，et al.Modeling glycogenstorage and denitrification capability of microorganisms in enhanced biological phosphate removal processes［J］.Water Sci Technol，1995，31，25-34.

［2］LIU W T，MINO T，NAKAMURA K，et al.Glycogen accumulating population and its anaerobic substrate uptake in anaerobic-aerobic activated sludge without biological phosphorus removal［J］.Water Research，1996，30(1):75-82.

［3］ZHANG T，LIU Y，FANG H H P.Effect of pH change on the performance and microbial community of enhanced biological phosphate removal process［J］.Biotechnol Bioeng，2005，92(2)，173-182.

［4］SERAFIM L S，LEMOS P C，REIS M A M.Effect of pH control on EBPR stability and efficiency［J］.Water Sci Technol，2002，46(4/5)，179-184.

［5］OEHMEN A，SAUNDERS A M，VIVES M T，et al. Competition between polyphosphate and glycogen accumulating organisms in enhanced biological phosphorus removal systems with acetate and propionate as carbon sources［J］.J Biotechnol，2006，123(1)，22-32.

［6］PANSWAD T，DOUNGCHAI A，ANOTAI J.Temperature effect on microbial community of enhanced biological phosphorus removal system［J］.Water Res，2003，37 (2)，409-415.

［7］OEHMEN A，LEMOS P C，CARVALHO G，et al.Advances in enhanced biological phosphorus removal:From micro to macro scale［J］.Water Res，2007，41(11)，2271-2300.

［8］AMMAN R I，BINDER B J，OLSON R J，et al.Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations［J］.Appl Environ Microbiol，1990，56(6)，1919-1925.

［9］DAIMS H，BRUHL A，AMANN R，et al.The domainspecific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria:Development and evaluation of a more comprehensive probe set［J］.Syst Appl Microbiol，1999，22(3)，434-444.

［10］CROCETTI G R，HUGENHOLTZ P，BOND P L，et al. Identification of polyphosphate-accumulating organisms and design of 16S rRNA-directed probes for their detection and quantitation［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66(3)，1175-1182.

［11］WONG M T，TAN F M，NG W J，et al.Identification and occurrence of tetrad-forming Alphaproteobacteria in anaerobic-aerobic activated sludge processes［J］.Microbiology，2004，150，3741-3748.

［12］AMANN R I.In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes［C］//AKKERMANS A D L，ELSAS J D，DE BRUIJ F J，editors.Molecular microbial ecology manual.London:Kluwer，1995:1-15.

［13］ERDAL U G，ERDAL Z K，RANDALL C W.The competition between PAOs(phosphorus accumulating organisms)and GAOs(glycogen accumulating organisms)in EBPR(enhanced biological phosphorus removal)systems at different temperatures and the effects on system performance［J］.Water Sci Technol，2003，47(11)，1-8.

［14］LOPEZ-VAZQUEZ C M，OEHMEN A，HOOIJMANS C M，et al.Modeling the PAO—GAO competition:Effects of carbon source，pH and temperature［J］.Water Research，2009，43(2)，450-462.

［15］亢 涵，王秀蘅，李楠，等.生物除磷系統(tǒng)啟動期聚磷菌的FISH原位分析與聚磷特性［J］.環(huán)境科學，2009，30(1):80-84.