趙 鑫，邢德峰，王靜怡，張 璐，任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090，dxing@hit.edu.cn)

生物制氫技術(shù)具有清潔能源生產(chǎn)和環(huán)境友好等特點(diǎn)引起廣泛關(guān)注［1-2］.近年來，國內(nèi)外關(guān)于生物制氫的研究主要集中在反應(yīng)器開發(fā)、運(yùn)行工藝優(yōu)化調(diào)控、產(chǎn)氫群落及其高效菌種和產(chǎn)氫代謝機(jī)制等方面.其中在產(chǎn)氫細(xì)菌分離和培養(yǎng)方面已有大量的研究成果報(bào)道［3-10］.如任南琪［11］等人早在上個(gè)世紀(jì)90年代就已經(jīng)率先開展活性污泥法生物制氫研究，完成了生物制氫示范工程，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不同于傳統(tǒng)丁酸型發(fā)酵的全新產(chǎn)氫發(fā)酵類型——乙醇型發(fā)酵［12］.2005年邢德峰等分離并獲得了乙醇型發(fā)酵的主要產(chǎn)氫功能細(xì)菌，并確立新的種屬——哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(Ethanoligenens harbinense)［13-14］.

菌株YUAN-3［14］是本實(shí)驗(yàn)室從生物制氫反應(yīng)器中分離得到的一株高效產(chǎn)氫菌株.經(jīng)過16S rRNA (GenBank注冊(cè)號(hào)AY295777)比對(duì)與最相近的柔嫩梭菌(Clostridium leptum)相似性僅為92%，為一個(gè)全新的菌屬，命名為產(chǎn)乙醇桿菌屬，YUAN-3為模式菌株，它是已報(bào)導(dǎo)中唯一一株具有自凝集能力的產(chǎn)氫細(xì)菌，代謝末端產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2，已報(bào)道最大比產(chǎn)氫率可達(dá)1.9 mol/mol-glucose［15］.

哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌產(chǎn)氫過程進(jìn)行乙醇型代謝，在發(fā)酵末端產(chǎn)物、pH值和產(chǎn)氫能力等諸多方面都不同于傳統(tǒng)的丁酸型發(fā)酵體系，因而其產(chǎn)氫過程中很多機(jī)理亟需探討.在前期研究中，林海龍［16］等克隆得到了該菌屬另一菌株B49的乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶等關(guān)鍵代謝酶，但是仍沒能夠更確切地詮釋這一新的代謝類型.因此，構(gòu)建哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬模式菌株YUAN-3的基因組文庫，尋找更多的關(guān)鍵酶和功能基因，可以更好地了解乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵代謝和生理生化特征.

1 試驗(yàn)

1.1 材料

菌株和質(zhì)粒:Ethanoligenens harbinense YUAN -3由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌Escherichia coli DH5α和質(zhì)粒pUC 19購自大連TaKaRa生物公司.

酶和主要試劑:Sau 3A I、BamH I限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、堿性磷酸酶 (CIAP)、DNA Marker、Taq酶等購自大連寶生物公司;Tris、Amp抗生素、IPTG、X-gal購自Sigma公司;氯仿、飽和酚等購自上海生工公司.DNA抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自上海華舜生物公司.

培養(yǎng)基:產(chǎn)氫液體培養(yǎng)基為LM-1培養(yǎng)基［17］;大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)［18］.

1.2 方法

1)基因組DNA的提取

在有10 mL LM-1培養(yǎng)基的厭氧管中，按照1∶100的比例接入菌株YUAN-3，37°C下140 r/min培養(yǎng)52 h，待菌體形成大的絮凝顆粒產(chǎn)生較多氫氣時(shí)，用離心管收集菌體，12 000 r/min離心1 min去上清，用PBS重懸洗兩次，取沉淀按照上海華舜公司的DNA抽提試劑盒說明抽提總DNA.

2)基因組酶切制備DNA片段

基因組DNA 40 μL，Sau3A I 1 μL，10×H Buffer 5 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL體系，酶切30 min.用0.9%的瓊脂糖電泳，切膠取1 000～7 500 bp的片段，按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收，用0.9%的瓊脂糖電泳檢測(cè)回收效果.

3)載體pUC 19的酶切和去磷酸化

按照pUC 19質(zhì)粒10 μL，BamH I酶2 μL，10 ×H Buffer 3 μL，ddH2O 15 μL配成30 μL體系，37℃酶切2 h，用0.9%的瓊脂糖檢測(cè)酶切結(jié)果，用未經(jīng)酶切的質(zhì)粒做比照.使用CIAP 2 μL，10× Buffer 5 μL，酶切的 pUC 19質(zhì)粒26 μL，ddH2O 17 μL配成50 μL體系.37℃反應(yīng)30 min，0.9%的瓊脂糖電泳膠回收.

4)載體與回收片段的連接

將回收的片段 10 μL，酶切 pUC 19載體1 μL，T4連接酶2 μL(15 U/μL)，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，50%PEG 1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL，16℃連接過夜.

5)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和重組子篩選

熱擊轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)［19］，熱擊90 s.在其中加入900 μL的LB培養(yǎng)基，37℃ 140 r/min培養(yǎng)2 h，取100 μL菌液涂布在固體LB培養(yǎng)基表面，其中包括100 μg/mL的Amp，24 μg/mL的IPTG和40 μg/mL的X-Gal.用封口膜封好后，倒置放入37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)20 h.

6)重組質(zhì)粒的鑒定

經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，隨機(jī)選取200個(gè)白色單菌落，每個(gè)單菌落先挑出一部分到事先分裝好的1 mL的LB培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL的Amp)，另一部分挑入配好的PCR體系中，PCR反應(yīng)體系為25 μL，使用M13通用引物;反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;接下來進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng):94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸3 min;72℃最終延伸10 min.然后使用0.9%的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果.在離心管中的培養(yǎng)液送入37℃搖床，140 r/min培養(yǎng)3 h.對(duì)瓊脂糖電泳結(jié)果中出現(xiàn)目標(biāo)條帶的菌液送至上海生工公司測(cè)序.

7)序列結(jié)果分析

由生物公司測(cè)序結(jié)果在NCBI的核酸和蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取和不完全酶切

構(gòu)建基因組文庫的關(guān)鍵和前提是得到大量的高質(zhì)量基因組DNA.為得到適于構(gòu)建文庫的部分消化產(chǎn)物，DNA初始長度至少應(yīng)是用于克隆片段的4倍，否則酶切連接后產(chǎn)生的有效片段較少.本實(shí)驗(yàn)在部分酶切時(shí)選擇較高濃度的DNA酶切結(jié)果，分別切取在1 000～7 500 bp左右的片段進(jìn)行回收.(基因組電泳見圖1，部分酶切和膠回收結(jié)果見圖2)

圖1 基因組DNA組抽提結(jié)果

圖2 Sau 3A I酶切DNA及膠回收結(jié)果

2.2 質(zhì)粒pUC 19的酶切和去磷酸化

由于限制性內(nèi)切酶BamH I和Sau 3A I具有同樣的黏性末端，酶切后所產(chǎn)生的黏性末端能夠很好地連接，因而選用BamH I切割質(zhì)粒pUC 19 (酶切結(jié)果如圖3所示).在質(zhì)粒的提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度或試劑的原因，可能會(huì)使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生不同程度的斷裂.所以，多數(shù)質(zhì)粒抽提物種含有3種構(gòu)型的質(zhì)粒:共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)，質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂，超螺旋狀態(tài);開環(huán)DNA(ocDNA)，質(zhì)粒的一條鏈斷裂，松弛的環(huán)狀分子;線性DNA(lDNA)，質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂，線性分子.由于不同構(gòu)象的質(zhì)粒電泳遷移率不同，會(huì)呈現(xiàn)出3條熒光帶，其中超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒遷移速率較快，因此會(huì)在最前端，如圖3中泳道3所示，超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒數(shù)量最多，也證明提取的質(zhì)粒的完整性較高;經(jīng)過酶切后質(zhì)粒被切成相同的直線型構(gòu)象，所以只在2.7 kb處有唯一條帶.為了降低酶切后質(zhì)粒的自連，提高連接效率，實(shí)驗(yàn)采用堿性磷酸酶(CIAP)對(duì)酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化.在藍(lán)白斑篩選重組子時(shí)計(jì)算白斑所占比例將近95%，說明載體酶切后的去磷酸化取得了很好效果.如圖3所示.

圖3 Bam H I酶切pUC 19及去磷酸化結(jié)果

2.3 基因文庫容量計(jì)算

根據(jù)公式N=ln(1-P)/ln［1-(I/G)］(N為轉(zhuǎn)化子數(shù)，P為獲得目的基因的可能性，一般為99%，I為克隆片段的平均大小，G為基因組大小，雖然產(chǎn)乙醇桿菌屬基因組大小沒有完全確定，但是有報(bào)道的最相近的梭菌屬菌株平均的基因組為4.6 Mb［20］)，獲得目的基因的可能性為99%時(shí)，所需的最小基因文庫的轉(zhuǎn)化子數(shù)量為6.9× 103個(gè)，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化得到9×103多個(gè)轉(zhuǎn)化子，大于目標(biāo)要求，說明具有較高的庫容量.

2.4 重組子鑒定

隨機(jī)挑取的白色菌落培養(yǎng)，提取的重組質(zhì)粒，電泳遷移率均小于載體pUC 19，證明均有外源基因插入.如圖4所示.

圖4 抽提重組質(zhì)粒結(jié)果

2.5 新基因的發(fā)現(xiàn)

隨機(jī)挑取200個(gè)白色菌落，經(jīng)過菌落PCR檢查有重組子樣品送出測(cè)序.菌落PCR結(jié)果如圖5所示.

圖5 重組質(zhì)粒菌落PCR電泳圖

測(cè)序結(jié)果使用 NCBI的 nucleotide blast和blastx比對(duì)分析，200個(gè)測(cè)序結(jié)果中，大多數(shù)片段與一些經(jīng)過全基因組測(cè)序之后的細(xì)菌的假想蛋白(hypothetical protein)相似性很高，很多相似性在90%以上.在比對(duì)結(jié)果中，有49個(gè)包含功能蛋白基因的片段，其中涵蓋較大的如表1所示.這些片段特別是與數(shù)據(jù)庫中一些梭菌屬的對(duì)應(yīng)基因有很高的相似性和親緣性.

這些片段中，有5個(gè)包含了完整基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF):polysaccharide transporter、IstB helper protein、acetylornithine aminotransferase、hemerythrin-like metal-binding protein、phi13 family major tail protein.使用 Cassette PCR技術(shù)又獲得了hydroxylamine reductase和TerL兩個(gè)功能基因的ORF，并將序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，結(jié)果如表2所示.

表1 相似性較高的功能片段名稱

表2 獲得完整開放閱讀框的基因

3 討論

哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)是不同于傳統(tǒng)丁酸發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的新型產(chǎn)氫菌屬，它進(jìn)行特有的乙醇型發(fā)酵，在低pH條件下具有較高產(chǎn)氫率，且產(chǎn)氫能力與丁酸發(fā)酵類型相當(dāng).因此推斷該菌屬可能會(huì)存在不同于已知丁酸發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的代謝途徑.

本研究構(gòu)建了哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬模式菌株YUAN-3的基因組文庫，文庫容量達(dá)到理論要求.對(duì)其中200個(gè)序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析，并結(jié)合Cassette PCR技術(shù)共獲得7個(gè)基因的開放閱讀框.從200個(gè)序列比對(duì)的結(jié)果可以分析出，這些功能基因大多與梭菌屬有很高的相似性和同源性.兩個(gè)菌屬的細(xì)菌在發(fā)酵產(chǎn)氫時(shí)代謝類型不同，但從很多測(cè)序結(jié)果的高度相似性可以推斷，一定存在著某些特殊的功能基因或酶在關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)改變了細(xì)菌的代謝流，進(jìn)而影響了兩個(gè)菌屬細(xì)菌的發(fā)酵類型和末端產(chǎn)物，從而產(chǎn)生了不同的發(fā)酵類型.對(duì)這一特殊菌屬的細(xì)菌進(jìn)行全基因組測(cè)序分析將有助于了解其不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵類型，并可能推斷出新的代謝途徑，為此全基因組序列分析工作將逐步在后續(xù)研究中開展.

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