宋維彥,蘇永全,潘 瀅,曾凡榮,游欣欣

(1.廈門大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院,福建 廈門 361005;2.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,山東 日照 276826)

日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)是中國(guó)沿海重要的養(yǎng)殖品種之一,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速發(fā)展,加之養(yǎng)殖環(huán)境惡化,疾病頻繁發(fā)生。生產(chǎn)常常使用抗生素來(lái)中控制日本囊對(duì)蝦病害,由于缺乏相關(guān)的藥物、藥理和安全使用知識(shí),生產(chǎn)中往往濫用抗生素,從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,不僅治療效果差,而且造成環(huán)境的污染,并且直接影響到所生產(chǎn)對(duì)蝦的食用安全。因此,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中如何合理、安全地用藥,是目前水產(chǎn)疾病防治的研究重點(diǎn)之一。作者利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)研究了 SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。通過研究SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦體內(nèi)的分布、殘留與代謝規(guī)律,為SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦病害防治中的合理使用提供理論參考依據(jù),也可做為水產(chǎn)養(yǎng)殖合理用藥的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的日本囊對(duì)蝦(平均體長(zhǎng) 8.57cm,平均體質(zhì)量 7.54 g)取自福建東山縣大鏟對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng),在室內(nèi)水泥池(3 m×4 m× 0.9 m)暫養(yǎng)20 d,期間投喂鮮牡蠣(Crassostrea ariakensis)肉,每天換水1/3。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

注射所用藥物為 SMZ注射液(上海公誼獸藥廠生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)080309),SMZ質(zhì)量濃度為100 g/L。ERFX注射液(山東興邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)20080703),有效質(zhì)量濃度為300 g/L。

1.1.3 儀器、藥品

島津 SPD-M20A高效液相色譜儀、WH-1微型漩渦混合儀、Sigmr-3N30低溫高速離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、氮吹干儀、超聲波清洗器、勻漿機(jī)、精密取液器、離心管、0.2 μm過濾器、分析天平等。SMZ標(biāo)準(zhǔn)樣品(德國(guó)Dr.Enrenstorfer公司生產(chǎn),批號(hào)80214),ERFX標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Enrenstorfer公司生產(chǎn),批號(hào)72105),乙腈、二氯甲烷、正己烷、四丁基溴化銨均為色譜純,無(wú)水醋酸鈉、無(wú)水硫酸鈉、85%的磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、檸檬酸三鈉均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥

腹部肌肉注射給藥,注射前按設(shè)計(jì)濃度配制藥液,采用單次注射給藥,每尾蝦注射100 μL,SMZ、ERFX注射劑量分別是100,20 mg/kg。兩種藥物分別注射80尾,注射后放入培育池(1 m3)飼養(yǎng)。培育用水為沙濾海水,水溫21℃±0.5℃,鹽度29.91,連續(xù)充氣。

1.2.2 取樣

注射后0.25,0.5,1,2,3,4,6,12,24,36,48,72,96 h時(shí)間段取樣。每次取樣5尾對(duì)蝦。取樣部位：血淋巴、肝胰臟、腹部肌肉。血淋巴用1mL注射器取胸血竇抽取,放入2 mL凍存管保存;取樣所用注射器和存放樣品的凍存管提前用肝素鈉溶液浸泡、晾干。樣品置于-70℃冰箱保存。

1.2.3 色譜分析條件

用 VP-ODS 150L×4.6 C18 色譜柱;柱溫：室溫;進(jìn)樣量：20 uL,流速：0.5 mL/min;SMZ檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm;流動(dòng)相=水：乙腈：冰醋酸=81：18：1(v/v/v);ERFX檢測(cè)波長(zhǎng) 278 nm;流動(dòng)相=乙腈：四丁基溴化銨溶液(0.01 mol/L 磷酸調(diào)節(jié)至 pH3.1) =5：95(v/v)。

1.2.4 樣品處理

1.2.4.1 SMZ樣品處理

肝胰臟、肌肉和血淋巴SMZ樣品處理參見改進(jìn)的鄭宗林[1]對(duì)羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)處理方法。

1.2.4.2 ERFX樣品處理

肝胰臟、肌肉和血淋巴 ERFX樣品處理參照錢云云等[2,3]的改進(jìn)方法。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取SMZ和ERFX標(biāo)準(zhǔn)樣品,分別配成100 mg/L母液,用母液配成0.05,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00 mg/L的SMZ和ERFX標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。HPLC測(cè)定,作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.6 回收率的測(cè)定

采用加樣回收法,分別向空白組織加入0.1,0.5,1,5,10 mg/L,5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的SMZ和ERFX標(biāo)準(zhǔn)液1 mL,然后按樣品處理程序進(jìn)行處理,HPLC測(cè)定,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中藥物回收量,按照下列公式計(jì)算回收率：

回收率=樣品實(shí)測(cè)濃度/樣品的理論濃度×100%。

用Excel和藥動(dòng)學(xué)軟件3p97對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 回收率的測(cè)定

對(duì)5種不同濃度的SMZ和ERFX回收率的測(cè)定結(jié)果表明,SMZ回收率范圍在82.2%～96.27%,平均回收率：肌肉為 88.92%,肝臟為 90.09%,血淋巴為84.84%;ERFX回收率范圍在84.96%～94.47%,平均回收率：肌肉為 86.04%,肝臟為 89.14%,血淋巴為91.77%。詳見表1和表2。

表1 SMZ在日本囊對(duì)蝦3種組織中的回收率Tab.1 SMZ recovery rates in the hemolymph,muscle and liver of Marsupenaeus japonicus

表2 ERFX在日本囊對(duì)蝦3種組織中的回收率Tab.2 ERFX recovery rates in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別 HPLC檢測(cè)所得的峰面積為縱坐標(biāo),相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做回歸方程,儀器程序自動(dòng)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：

在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下,兩種藥物標(biāo)準(zhǔn)液的HPLC基線走動(dòng)基本平穩(wěn)。

2.3 注射后 2種藥物在日本囊對(duì)蝦 3種組織內(nèi)含量變化

給藥后,藥物在日本囊對(duì)蝦 3種組織內(nèi)不同時(shí)間含量變化數(shù)據(jù),用 Excel處理,得出兩種藥物在 3種組織內(nèi)藥-時(shí)變化曲線如圖1、圖2所示。

圖1 SMZ在日本囊對(duì)蝦3種組織內(nèi)的變化Fig.1 Changes of residual SMZ in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

圖2 ERFX在日本囊對(duì)蝦3種組織內(nèi)的變化Fig.2 Changes of residual ERFX in the hemolymph,muscle and liver of Marsupenaeus japonicus

從藥-時(shí)變化曲線的變化趨勢(shì)看,注射SMZ后血淋巴的藥物質(zhì)量比迅速上升,0.5 h達(dá)到183.37 μg/g的最高峰值,以后逐漸下降;肝臟的藥物質(zhì)量比在2 h內(nèi)迅速升高,2 h達(dá)到高峰值;藥物在肌肉內(nèi)的1 h達(dá)到90.2 μg/g的最大峰值。注射ERFX后血淋巴的藥物質(zhì)量比迅速上升,0.5 h達(dá)到27.01 μg/g的最高峰值,以后逐漸下降;肝臟的藥物質(zhì)量比在1 h內(nèi)迅速升高達(dá)到峰值。

2.4 兩種藥物在日本囊對(duì)蝦組織內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)方程及參數(shù)

將注射給藥后所測(cè)得濃度-時(shí)間數(shù)據(jù),使用藥物動(dòng)力學(xué)軟件3p97對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SMZ和ERFX兩種藥物的處理結(jié)果都為經(jīng)典的開放式模型。其在日本囊對(duì)蝦3種組織中的動(dòng)力學(xué)方程見表3、表4,動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表5。

表3 SMZ在日本囊對(duì)蝦3種組織內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)方程Tab.3 Pharmacokinetic equations for SMZ in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

表5 SMZ在日本囊對(duì)蝦3種組織內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.5 Pharmacokinetic parameters of SMZ and ERFX in the hemolymph,muscle,and liver of Marsupenaeus japonicus

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射方式,探討SMZ和 ERFX在日本囊對(duì)蝦體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué),給藥后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,只在藥物注射后3 h內(nèi)死亡1只,其他時(shí)間無(wú)死亡;在18,36 h分別有2只,48 h有1只正常脫皮,說(shuō)明注射法給藥對(duì)日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)沒有明顯的負(fù)面影響,且注射法給藥比投喂法和藥浴法給藥的藥物劑量準(zhǔn)確,藥物進(jìn)入體內(nèi)的時(shí)間基本一致。

3.1 SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦的動(dòng)力學(xué)特征比較

研究結(jié)果表明,單次肌肉注射方式給藥后,SMZ在肌肉和血淋巴中的動(dòng)力學(xué)方程藥物時(shí)量曲線關(guān)系符合開放一室模型;SMZ在肝臟的動(dòng)力學(xué)方程為開放的兩室模型。實(shí)驗(yàn)中不同組織的代謝適合不同的房室模型,這與中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[4]和羅氏沼蝦[1]各組織都為二室模型,花鱸(Lateolabrax japonicus)[5]各組織都是一室模型不盡相同。

從SMZ吸收半衰期看出,SMZ日本囊對(duì)蝦組織內(nèi)吸收速度比較快,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴吸收半衰期分別是0.495 2,0.097 1,0.017 0 h;藥物吸收后在 3種組織內(nèi)不是平均分布,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴達(dá)到的最高血藥質(zhì)量比最高峰分別為 96.771 6,89.831 7,75.106 1 μg/g;從濃度-時(shí)間曲線下面積AUC看,肝臟最大為1264.788 3(μg/g)/h,肌肉中最小為645.238 8(μg/g)/h,血淋巴中為1 008.185 0 (μg/g)/h;SMZ在日本囊對(duì)蝦3組織內(nèi)消除速度也不相同,肝臟、肌肉和血淋巴的消除半衰期分別為19.128 4,4.579 9,9.185 5 h,肌肉的消除半衰期最短,肝臟的消除半衰期最長(zhǎng)。與其他動(dòng)物相比,SMZ在草魚[6]體內(nèi)單方與復(fù)方口灌給藥其消除相半衰期分別為(13.31±0.61和12.64±0.55 h);羅氏沼蝦[1]肌注 SMZ,其在血淋巴中消除半衰期為 24.92 h;19℃條件下單次肌注,SMZ在中國(guó)明對(duì)蝦血淋巴內(nèi)的消除半衰期為 10.87 h[4]。在血淋巴中的消除半衰期和中國(guó)明對(duì)蝦相似,比羅氏沼蝦短。

ERFX肌肉注射方式給藥后,血淋巴和肝臟中的藥物動(dòng)力學(xué)方程時(shí)量曲線關(guān)系符合開放的一室模型;肌肉中為開放的二室模型。和 ERFX在羅氏沼蝦[2]的肌肉組織為二室模型相同,ERFX在鯉魚(Cyprinus carpio)[7]鯽魚(Carassius auratus)[8]血液中的代謝為一室模型,和日本囊對(duì)蝦血淋巴的代謝模型一致。

從吸收半衰期可以看出 ERFX在日本囊對(duì)蝦組織內(nèi)吸收速度非?？?注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴吸收半衰期分別是0.095 2,0.215 1,0.123 h,藥物吸收后在各組織內(nèi)不是平均分布的,不同組織達(dá)到的最高藥物質(zhì)量濃度不同,注射藥物后肝臟、肌肉和血淋巴達(dá)到的最高血藥質(zhì)量比最高值分別為 48.653,52.713 1,39.763 9 μg/g;從濃度-時(shí)間曲線下方的面積AUC來(lái)看,肌肉最大為756.024 6(μg/g)/h,肝臟最小為 363.478 0(μg/g)/h,血淋巴為 599.713 9(μg/g)/h;ERFX在日本囊對(duì)蝦的各組織內(nèi)消除速度并相同,其在肝臟、肌肉和血淋巴的消除半衰期分別為 4.760 3,24.805 4,10.370 8 h,肌肉的消除半衰期最長(zhǎng),肝臟的消除半衰期最短。與其他生物相比,如吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)的肝臟、肌肉、血漿對(duì)ERFX的消除半衰期分別為15.16,16.83,17.19 h,中國(guó)對(duì)蝦的肌肉對(duì)ERFX的消除半衰期為27.9 h[9],歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)肝臟、肌肉、血漿消除半衰期分別為59.32,901.24,908.07 h[10],日本囊對(duì)蝦在肝臟、肌肉和血淋巴中消除半衰期比羅非魚長(zhǎng)。但比歐洲鰻鱺的短,在肌肉中的消除半衰期比中國(guó)對(duì)蝦短。

3.2 SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦的代謝特征

注射SMZ后在日本囊對(duì)蝦3種組織內(nèi)吸收速度有較大差異,在血淋巴內(nèi)被迅速吸收,0.5 h即達(dá)到183.37 μg/g的最大值,但比中國(guó)明對(duì)蝦血淋巴在0.083 h血藥質(zhì)量比即達(dá)到峰值時(shí)間長(zhǎng)[4];在肌肉組織的達(dá)到峰值的時(shí)間是1 h,質(zhì)量比為90.2 μg/g;肝臟中藥物達(dá)峰時(shí)間是2 h,質(zhì)量比為154.92 μg/g。

注射ERFX后日本囊對(duì)蝦體3種組織對(duì)藥物吸收速度有較大差異,在血淋巴內(nèi)被迅速吸收,0.5 h即達(dá)到 27.01 μg/g的最大值;藥物在肌肉和肝臟達(dá)到峰值的時(shí)間都是 1 h,質(zhì)量比分別為 9.26和 49.76μg/g;從圖1、圖2中變化曲線可以看出注射藥物后,在 3種組織內(nèi)很快達(dá)到峰值,之后藥物在組織內(nèi)的含量開始下降,從出現(xiàn)峰值到48 h藥物含量下降幅度較大,48 h后下降幅度緩慢。到96 h各組織中的含量都大于0.1 μg/g。這兩種藥物注射后都能很快被吸收,在血淋巴中達(dá)到最大濃度的時(shí)間相似,但在血淋巴吸收利用卻有差別,血淋巴對(duì)SMZ吸收利用是注射濃度的 1.833倍比 ERFX的 1.351倍高;注射ERFX后肝臟中出現(xiàn)峰值時(shí)間要比注射SMZ早1 h。

3.3 SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦中的應(yīng)用

為了獲得較理想的防治效果,水產(chǎn)用藥常采用多次給藥以維持一定的血藥水平,多劑量給藥一般是固定用藥的劑量和間隔時(shí)間。日本囊對(duì)蝦肌肉、血淋巴和肝臟是主要的發(fā)病部位,如肌肉白濁病、肝胰臟白濁病、紅腿病等。根據(jù)SMZ和ERFX藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)和代謝特點(diǎn),發(fā)病組織是血淋巴時(shí),選用

SMZ防治能在發(fā)病部位獲較高的藥物濃度,肝組織發(fā)病選用 ERFX防治能在發(fā)病部位獲較高的藥物濃度。根據(jù)SMZ和ERFX在血淋巴中消除半衰期分別為9.19和10.37 h,在日本囊對(duì)蝦的血淋巴中屬于慢速消除類藥物[11],若血淋巴發(fā)病用這兩種藥物治療,則建議每天用藥2～3次,最好1次／8 h或1次／12 h,使藥血濃度在用藥期間維持在較高的水平;SMZ在肌肉中和ERFX肝臟中消除半衰期分別為4.58 d和4.76 d,屬于中速[12]消除藥物,若肌肉中發(fā)病需要用SMZ或肝臟中發(fā)病需要用 ERFX進(jìn)行治療,建議采用3～4次／d的給藥方案,最好1次／6 h或1次／8 h;但是對(duì)蝦發(fā)病時(shí),常表現(xiàn)癥狀和發(fā)病部位不全一致的,或出現(xiàn)多部位發(fā)病,這時(shí)應(yīng)考慮綜合因子,用這兩種藥物防治時(shí),建議每天給藥3次,連用2 d。經(jīng) 5～6個(gè)劑量后,藥物在體內(nèi)的累積量約達(dá) 95%左右,基本達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)[11]。若再繼續(xù)多次用藥,其藥血濃度則可能遠(yuǎn)超過第一次用藥的濃度,可能會(huì)發(fā)生副作用。

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY5070-2002),SMZ在水產(chǎn)品中的最高殘留限量為0.1μg/mL。農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-2-2006中規(guī)定ERFX殘留量小于0.1 μg/g。比較SMZ和ERFX在日本囊對(duì)蝦肝臟、肌肉和血淋巴等組織的濃度變化,SMZ在血淋巴中的濃度相比較大而 ERFX在肝臟中較大,但變化趨勢(shì)相近,都是經(jīng)吸收達(dá)峰值后逐漸變小,在48 h內(nèi)降解較快,但是在96 h內(nèi)兩種藥在各個(gè)組織內(nèi)的含量都大于 0.1 g/g。雖然肌肉是對(duì)蝦可食性組織,但是在食用對(duì)蝦時(shí)不能把肝臟和血淋巴有效地分開,常常都是同時(shí)食用。因此判定休藥期要按照各組織中半衰期最長(zhǎng)的組織含量的消除來(lái)定,結(jié)合SMZ和ERFX在肌肉中的消除規(guī)律,在21℃±0.5℃的條件下。建議SMZ在日本囊對(duì)蝦的休藥期不少于10 d,ERFX在日本囊對(duì)蝦的休藥期不少于12 d。

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