(煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

多糖分子修飾的方法主要有硫酸化、羧乙基化、羧甲基化以及雙基團(tuán)衍生化等[1]。其中,多糖的硫酸化修飾由于具有獨(dú)特的作用而成為研究的熱點(diǎn)。硫酸化多糖的抗病毒作用在艾滋病治療上得到證實(shí)[2]。硫酸化修飾后的茯苓多糖(pachymaran)能溶于水,并增強(qiáng)了機(jī)體的免疫功能,具備抗腫瘤、抗病毒等活性多糖的硫酸化為多糖帶來了新的活性和功能[3]。

κ-卡拉膠(KC)具有優(yōu)良的熱可逆凝膠化、抗蛋白凝結(jié)、親水無毒等獨(dú)特性能,在食品、化工和包裝等方面應(yīng)用廣泛[4]。特別是近年來在醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用,更引起了人們的研究興趣。近來研究發(fā)現(xiàn)卡拉膠本身就具有特殊的醫(yī)藥療效,它對(duì)許多重要病毒病原(如皰疹病毒、HIV、粘液病毒、棒狀病毒等) 具有廣譜抑制活性,還對(duì)免疫系統(tǒng)具有持續(xù)性作用,它是有效的抗胃蛋白酶活、抗?jié)儭⒖鼓?、抗栓物質(zhì)[5]。而硫酸基對(duì)卡拉膠的生物活性具有關(guān)鍵作用。Carlucci等[6]的研究表明,如將多糖上的硫酸根除去,則卡拉膠抑制皰疹病毒復(fù)制的作用隨之消失。Yamada等[7]發(fā)現(xiàn)硫酸化修飾的κ-卡拉膠的抗HIV活性較κ-卡拉膠原糖增加。本實(shí)驗(yàn)室從角叉菜(Chondrus Ocellatus)中采用水提醇沉法提取角叉菜卡拉膠,對(duì)其進(jìn)行分級(jí)處理得到κ-卡拉膠(KC),采用氯磺酸-吡啶法對(duì)κ-卡拉膠進(jìn)行硫酸化修飾。并對(duì)角叉菜卡拉膠及其硫酸化衍生物對(duì)細(xì)胞的免疫活性進(jìn)行初步比較研究,探討硫酸化修飾對(duì)κ-卡拉膠生物活性的影響,以期通過分子修飾技術(shù)提高角叉菜卡拉膠的生物功效。

1 材料與方法

1.1 κ-卡拉膠的制備

干燥角叉菜粉碎后,經(jīng)熱水浸提(80℃)、離心、KCl分級(jí)、濃縮、乙醇沉析、復(fù)溶、透析、沉析、洗滌、真空干燥等工藝得到角叉菜多糖κ-卡拉膠,經(jīng)液相檢測測定的κ-卡拉膠的分子質(zhì)量為 1 771 721 u,硫酸化修飾的卡拉膠的分子質(zhì)量為1 737 953 u。

1.2 試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)液：美國 HyClone公司(批號(hào)：AMC15824),加10%小牛血清、雙抗、HEPES;小牛血清：美國HyClone公司;MTT(噻唑藍(lán)),Sigma公司產(chǎn)品;DMSO：AMRESCO分裝;氯磺酸、吡啶、甲酰胺、刀豆蛋白等均為分析純或生化試劑;昆明種小鼠(BALB / c),雄性,體質(zhì)量32 g,購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

ELX-800酶聯(lián)免疫檢測儀：美國 Bio-Tek Instruments INC.;LabTeach UV-1100型紫外分析儀：美國萊伯泰科公司;Shimadzu IR-400型紅外光譜儀：日本島津株式會(huì)社。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 角叉菜κ-卡拉膠的硫酸化修飾

采用氯磺酸- 吡啶法[8]對(duì)角叉菜κ-卡拉膠進(jìn)行硫酸化修飾。在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的三頸燒瓶中加入預(yù)冷的無水吡啶,并將燒瓶置于冰鹽浴中攪拌,再將氯磺酸于40 min內(nèi)逐滴加入。滴加完畢后撤去冰鹽浴,室溫下加入1.0 g角叉菜κ-卡拉膠與30 mL甲酰胺懸液,60℃下攪拌2 h,將三頸燒瓶置于100 mL冰水中結(jié)束反應(yīng),用1 mol/L NaOH中和至pH 7.5。加入3倍體積的無水乙醇,靜置、離心,洗滌3次,將沉淀自來水透析3 d,對(duì)蒸餾水透析1 d。真空冷凍干燥得到角叉菜κ-卡拉膠硫酸化衍生物。

2.2 κ-卡拉膠的硫酸基含量測定

用氯化鋇-明膠法[9]測定硫酸化前后κ-卡拉膠的硫酸基含量。

2.3 紫外光譜分析

將多糖樣品配成 0.1 %水溶液,在 LabTeach UV-1100型紫外分析儀上對(duì)200～500 nm 區(qū)間進(jìn)行掃描。

2.4 硫酸化κ-卡拉膠的免疫活性研究

2.4.1 SKC對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

小鼠脫頸處死,無菌取脾,將脾放入已消毒的平皿中,用 RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)沖脾,碾磨獲取脾細(xì)胞懸液,裂解紅細(xì)胞,離心洗滌,最后用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為 2×106個(gè)/mL的脾細(xì)胞懸液,備用。用完全培養(yǎng)液配制 50 mg/L ConA(刀豆蛋白)溶液備用。實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度的卡拉膠,使其最終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400 mg/L,于 96孔培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液,再加 100 μL 培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、10 mg/L ConA(陽性對(duì)照)及含有不同濃度的以培養(yǎng)基配制的樣品溶液,振蕩混勻后,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。終止培養(yǎng)前 4 h,每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,小心吸棄上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩10 min使紫色結(jié)晶完全溶解,以調(diào)零復(fù)孔調(diào)零(以培養(yǎng)液調(diào)零),在酶標(biāo)儀上測各孔的吸光值(測定波長570 nm,參比波長630 nm)

淋巴細(xì)胞增殖率(%)=多糖刺激孔吸光度值/空白對(duì)照孔吸光度值×100

2.4.2 SKC對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖作用的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7,胰酶消化收集細(xì)胞,用含 10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,加入96孔板,100 μL/孔,貼壁 2 h 后,換新鮮培養(yǎng)液 100 μL,再加100 μL 培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、LPS(脂多糖)陽性對(duì)照(終濃度為 2 mg/L)、及含有不同濃度的樣品溶液,于37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h。

吸棄上層培養(yǎng)液,補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)液100 μL/孔,同時(shí)加入5 g/L的MTT 20μL/孔,同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕吸棄上清,加入150 μL DMSO震蕩10 min,充分混勻,置室溫 10 min后,用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光值。吸光度越大,表明免疫活性越高。

2.4.3 SKC對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

采用亞硝酸鹽法測定[10],取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL。96孔板每孔接種 100 μL,每個(gè)樣品設(shè)置 6個(gè)重復(fù)孔。37°C,5%CO2培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)24 h。按照需要的濃度加入100 μL樣品,脂多糖溶液(陽性對(duì)照,其終質(zhì)量濃度為4 mg/L),空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,從每個(gè)孔取 50μL 培養(yǎng)上清液到一個(gè)新的 96孔板中,測540 nm處的吸光度,每個(gè)濃度6 個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件中的One Way ANOVA進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較,用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)之間的比較。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 κ-卡拉膠硫酸化修飾后硫酸基含量

本實(shí)驗(yàn)采用較溫和的條件,即氯磺酸與吡啶質(zhì)量比 1 ：3,反應(yīng)溫度 60℃,時(shí)間 1.5 h, 對(duì)角叉菜λ-卡拉膠進(jìn)行硫酸化修飾,采用氯化鋇-明膠法將樣品數(shù)據(jù)代入硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(見圖1),可得硫酸化修飾前后樣品的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 21.64%±1.36%,32.58%±0.92%;紫外掃描結(jié)果顯示在200～400 nm無吸收(圖2),說明樣品不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖1 硫酸基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of O-SO3-

圖2 KC和SKC紫外光圖譜Fig.2 Ultraviolet spectra of KC and SKC

3.2 對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

由圖3可見25～400 mg/ L的KC和SKC均能刺激小鼠 T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),均有促增殖作用,其中SKC對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞促增殖作用更強(qiáng)。與陽性對(duì)照 ConA(10 mg/ L)誘導(dǎo)的 T淋巴細(xì)胞增殖相比,KC在25～100 mg/ L濃度范圍內(nèi),對(duì)淋巴細(xì)胞的促增殖作用不如陽性對(duì)照,而 SKC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用則優(yōu)于陽性對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍100～400 mg/ L內(nèi),SKC對(duì)T淋巴細(xì)胞促增殖作用均優(yōu)于KC (P＜0.01),并且本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)SKC顯示出小鼠淋巴細(xì)胞促增殖作用的劑量依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示硫酸化卡拉膠對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞免疫存在較佳的促進(jìn)作用,效果要優(yōu)于卡拉膠。

圖3 KC和SKC對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用Fig.3 Effects of KC and SKC on the proliferation of mouse peritoneal macrophage

3.3 對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

由圖4可見,與對(duì)照組比較,KC及SKC低劑量(25 mg/ L)組未能明顯提高單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的增殖活性,在質(zhì)量濃度大于(100 mg/L)兩者均能促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞 RAW264.7增殖(P＜0.05),而且在100～400 mg/ L范圍內(nèi)SKC的作用均要顯著強(qiáng)于KC (P＜0.01)。質(zhì)量濃度在50～400 mg/L之間時(shí),SKC可顯著的促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7增殖,其作用的強(qiáng)弱隨濃度變化,隨著濃度的提高,促進(jìn)作用不斷增強(qiáng),表明SKC對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。SKC的增殖效果較顯著,在高濃度時(shí)甚至優(yōu)于陽性藥LPS。

圖4 KC和SKC對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用Fig.4 Effects of KC and SKC on the proliferation of mouse peritoneal macrophage

3.4 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y= 0.007x+ 0.1269,R2= 0.9972,求得NO的含量,NO含量測定結(jié)果表明,與空白對(duì)照相比,KC和SKC的高低劑量組均能提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO量(P＜ 0.05),其中SKC促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性較KC更強(qiáng)(P＜0.01),并呈一定的劑量依賴性。如圖5所示,KC樣品在25～400 mg/L的濃度范圍內(nèi),促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO低于LPS陽性對(duì)照組;而SKC質(zhì)量濃度大于100 mg/L時(shí),其效果就優(yōu)于LPS陽性對(duì)照組。

圖5 KC 和SKC對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO合成的誘導(dǎo)作用Fig.5 Nitric oxide production by murine peritoneal macrophages induced by KC and SKC

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn),κ-卡拉膠經(jīng)硫酸化修飾后,對(duì)代表細(xì)胞免疫的淋巴 T細(xì)胞和作為機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的增殖作用比κ-卡拉膠原糖得到了增強(qiáng),另外,SKC在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO的生成方面比KC也有所增加,說明SKC能很好地介導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞,具有潛在的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用。這些活性的增加,可能是因?yàn)槎嗵堑纳锘钚耘c其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)緊密相關(guān),而κ-卡拉膠在硫酸酯化后,所帶硫酸基團(tuán)的空間位阻和靜電排斥效應(yīng)改變了κ-卡拉膠原來的空間結(jié)構(gòu),增加了糖鏈的屈伸度,提高了水溶性,從而引起生物活性的改變。

SKC除了對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒作用外,還能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用,克服了化療藥物在抗腫瘤的同時(shí)對(duì)機(jī)體免疫功能的影響,具有一定的開發(fā)前景。

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