闞伯紅 張海霞 于建春 韓景獻(xiàn)

G蛋白是位于細(xì)胞膜上重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可被膜受體G蛋白結(jié)合受體（GPCR）激活，傳遞多種膜外信號(hào)進(jìn)入膜內(nèi)。Gαq/11可激活磷脂酰肌醇特異的磷脂酶C，而GαS和Gαi/o參與腺苷酸環(huán)化酶的激活和抑制。越來越多的研究表明在阿爾茨海默?。ˋD）中存在G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常[1-3]。本研究利用Western-blot方法分別檢測(cè)快速老化癡呆小鼠SAMP8和相應(yīng)月齡的正常老化小鼠SAMR1中Gαq/11、Gαi和GαS蛋白的表達(dá)情況，為AD的發(fā)病研究和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 甘氨酸、Tris堿、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺等購自BBI公司，SDS和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，蔗糖購自北京普博欣生物公司，脫脂奶粉購自BD公司，磷酸二氫鈉、甲醇和氯化鈉等購自天津市化學(xué)試劑公司，Tween-20購自北京鼎國(guó)公司，兔多克隆抗體Gαs、兔多克隆抗體Gαi、PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒購自美國(guó)Millipore公司，兔多克隆抗體Gαq/11購自美國(guó)Santa Cruze公司，親和純化山羊抗兔IgG購自美國(guó)KPL公司，漿膜蛋白提取試劑盒購自BioVision公司（Catalog#K268-50）。

1.1.2 主要儀器 DYY-11型電泳儀、DYCA-24D雙垂直板電泳槽購自北京市六一儀器廠，高能小型轉(zhuǎn)膜儀、UNIVERSAL 16R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)均購自美國(guó)GE公司，TS-1型脫色搖床購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Quantity one凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司，AL104型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，酶標(biāo)儀購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方法 所取雄性小鼠均由天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均為二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都在完全一致的生活環(huán)境和飲食條件下飼養(yǎng)，進(jìn)食方式為自由進(jìn)食，在特制的鼠籠，每籠5只小鼠，每周更換鼠籠一次，室溫為（22±2）℃，以排除飲食及環(huán)境等所有可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因表達(dá)產(chǎn)生影響的因素。選取8月齡雄性SAMP8 5只，8月齡雄性SAMR1 5只，另取18月齡雄性SAMP8 5只，18月齡雄性SAMR1 5只，以SAMR1作為正常對(duì)照組。

1.2.2 漿膜蛋白的制備 脫臼處死后迅速取出海馬和大腦皮質(zhì)組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗去血漬，稱質(zhì)量后完全按試劑說明書制備漿膜蛋白。-70℃保存。

1.2.3 Western-blot方法測(cè)定G蛋白表達(dá)水平 將漿膜蛋白溶解于適量的PBS（含0.5%Triton X-100）緩沖液，以BCA法測(cè)定蛋白濃度,以上述緩沖液將蛋白濃度調(diào)成一致，加入5×上樣緩沖液。100℃變性5 min，瞬時(shí)離心。用10%的聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，用Amersham公司生產(chǎn)的彩虹預(yù)染Marker作為分子質(zhì)量依據(jù)，樣品每孔上樣量40 μg，上8板膠，其中2板用于染色確定上樣量的一致性，另6板用電轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。沿分子質(zhì)量標(biāo)記將膜剪成上下兩部分，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別與Gαq/11（1∶1 000）、Gαi（1∶2 000）和Gαs（1∶1 000）抗體4℃過夜。以TBST洗去未結(jié)合的抗體后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG（1∶2 000）抗體室溫作用2 h。TBST充分洗滌后，用增強(qiáng)型ECL試劑盒顯影1 min，置于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.2.4 Western-blot的結(jié)果分析和質(zhì)量控制 對(duì)拍照結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用相對(duì)表達(dá)量表示。質(zhì)量控制時(shí)，根據(jù)分析同時(shí)電泳副本膠的影像來校準(zhǔn)上樣量的偏差，同一板膠同時(shí)上對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的樣品排除不同批次在條件不同時(shí)造成的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間比較，采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在8月齡小鼠中的表達(dá) 與同月齡SAMR1相比，SAMP8皮質(zhì)和海馬中Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 Gαq/11、Gαi和Gαs蛋白在18月齡小鼠中的表達(dá) 小鼠SAMP8皮質(zhì)和海馬中Gαq/11的表達(dá)量均低于同月齡對(duì)照小鼠SAMR1的表達(dá)量（P＜0.05），而Gαi的表達(dá)量只在海馬中明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 月齡小鼠2組間皮質(zhì)、海馬中蛋白的相對(duì)表達(dá)量 （n=5，±s）

表1 月齡小鼠2組間皮質(zhì)、海馬中蛋白的相對(duì)表達(dá)量 （n=5，±s）

均P＞0.05

皮質(zhì) 海馬組別SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 9.81±2.35 10.19±2.66 0.24 Gαi 11.70±4.50 8.30±1.37 1.62 Gαs 10.21±2.16 9.79±1.26 0.38 Gαq/11 11.01±6.91 8.99±4.89 0.53 Gαi 11.20±5.03 8.80±3.06 0.91 Gαs 11.06±4.17 8.94±3.79 0.83

表2 18月齡小鼠2組間皮質(zhì)、海馬中蛋白的相對(duì)表達(dá)量 （n=5，±s）

表2 18月齡小鼠2組間皮質(zhì)、海馬中蛋白的相對(duì)表達(dá)量 （n=5，±s）

＊P＜0.05

皮質(zhì) 海馬組別SAMR1 SAMP8 t Gαq/11 10.05±2.24 6.62±1.88 2.87＊Gαi 9.83±3.91 6.83±2.42 1.15 Gαs 9.28±2.40 7.39±1.58 1.62 Gαq/11 9.40±0.62 7.27±1.73 2.84＊Gαi 10.58±2.61 6.08±2.34 3.15＊Gαs 9.27±2.16 7.40±2.58 1.36

3 討論

既往大多數(shù)研究者普遍采用AD患者死后尸檢腦組織作為研究對(duì)象，并分別選取腦組織的不同部位對(duì)Gαq/11、Gαi和Gαs等的表達(dá)量和活性進(jìn)行研究，但是由于尸檢組織來源有限，標(biāo)本不新鮮和死因各異等缺陷，致使所得結(jié)果存在很大差異[4]。

而本研究采用SAMP8小鼠為研究對(duì)象，克服了上述研究的缺陷。SAMP8是一種自然發(fā)病、伴快速老化的AD模型鼠，它與人類衰老和癡呆的臨床特征比較接近，是一種較好的研究AD早期病理生理改變的動(dòng)物模型[5]。在筆者前期的研究中，SAMP8在8月齡即出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)和記憶障礙，并隨增齡而病情加重[6]。本研究分別選取8月齡和18月齡SAMP8來研究AD發(fā)病早期和晚期時(shí)Gαq/11、Gαi和Gαs的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，SAMP8在8月齡時(shí)皮質(zhì)和海馬中Gαq/11、Gαi和Gαs的表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化，這與AD早期體內(nèi)對(duì)G蛋白信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)有關(guān)，使其不至于嚴(yán)重影響G蛋白下游信號(hào)分子和產(chǎn)物。小鼠SAMP8的平均壽命為16個(gè)月，到18個(gè)月時(shí)，小鼠SAMP8的各種生理功能都已進(jìn)入終末階段。相對(duì)于同月齡正常對(duì)照SAMR1，SAMP8在18月齡時(shí)，皮質(zhì)中的Gαq/11出現(xiàn)減低，海馬中的Gαi和Gαq/11均降低，而Gαs均無明顯變化。此結(jié)果部分與過去研究AD死后患者所得結(jié)果一致[7]。同時(shí)，在AD晚期，相對(duì)于皮質(zhì)而言，海馬中Gαi和Gαq/11的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯減低，這與海馬是學(xué)習(xí)記憶形成的關(guān)鍵部位、對(duì)外界損傷最敏感的部位有關(guān)。與腺苷酸環(huán)化酶途徑相比，AD中磷脂酰肌醇途徑受到的損傷相對(duì)更廣泛，最終通過PKC缺陷導(dǎo)致AD的發(fā)生[8]。筆者今后將進(jìn)一步測(cè)定Gαq/11和Gαi下游信號(hào)分子的表達(dá)和活性，以期為AD的治療提供準(zhǔn)確的作用靶點(diǎn)。

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