龔琪 談凌凌 林薇 王哲 徐振海

體外循環(huán)對(duì)血小板 CD40L表達(dá)的影響

龔琪 談凌凌 林薇 王哲 徐振海

目的 研究體外循環(huán)(CPB)過程中血小板膜表達(dá)CD40L的變化,及其與血小板激活、全身炎癥反應(yīng)及凝血變化的聯(lián)系。方法 CPB心內(nèi)直視手術(shù)患者 40例,分別于麻醉誘導(dǎo)后 10min(T1)、CPB后 30m in(T2)、CPB停機(jī)即刻(T3)、CPB后 2h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取外周動(dòng)脈血,測(cè)定血漿 TNF-α濃度、血小板表面CD 40L和 CD 62P表達(dá),計(jì)算術(shù)后 24 h縱隔引流量。結(jié)果 T2時(shí) CD 40L較 CPB前明顯升高(P＜0.01),T3時(shí)達(dá)到峰值,T6時(shí)恢復(fù)到T1水平。血小板 CD 62P表達(dá)、血漿腫瘤壞死因子-α的峰值、術(shù)后 24 h引流量均和CD 40L表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.610,P＜0.01)。結(jié)論 CD40L是隨著CPB對(duì)血小板的激活而表達(dá)的,CD 40L可能是聯(lián)系炎性反應(yīng)和凝血異常這兩個(gè)導(dǎo)致CPB術(shù)后主要并發(fā)癥的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

體外循環(huán);血小板;CD40L;并發(fā)癥

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)激活血小板引起機(jī)體的炎性反應(yīng)以及凝血功能的變化是心臟外科手術(shù)術(shù)后出血、栓塞、心肌損傷、多器官功能衰竭等一系列并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)[1],但其機(jī)制尚未完全闡明。CD 40L作為由血小板表達(dá)又和炎癥、凝血有關(guān)的一種蛋白,當(dāng)某種條件下血小板被激活后,迅速表達(dá)于血小板表面,并可和其裂解生成的血漿可溶產(chǎn)物sCD 40L(Soluble CD 40L)共同發(fā)揮生理作用,體內(nèi)的CD40L主要來源于血小板[2]。本試驗(yàn)通過檢測(cè)行心內(nèi)直視手術(shù)患者在CPB前后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)血小板膜表達(dá)CD40L和血小板激活標(biāo)志物 CD 62P的情況、血漿中的炎性反應(yīng)標(biāo)志物腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度及患者術(shù)后 24h縱隔引流量來探討 CPB對(duì)血小板表達(dá) CD 40L的影響,CD 40L和血小板激活標(biāo)志物 CD 62P、炎性反應(yīng)標(biāo)志物 TNF-α、術(shù)后出血量的關(guān)系,從而對(duì) CPB過程中血小板CD40L的表達(dá)規(guī)律以及其與CPB引起的炎癥、凝血異常的關(guān)系做探討,為更有效的減少CPB并發(fā)癥從而提高手術(shù)效果提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2006年 1至 12月在我科住院行心內(nèi)直視手術(shù)的房室水平左向右分流的先天性心臟病(先心病)患兒40例,其中男 26例,女 14例;年齡 7個(gè)月 ～13歲,平均年齡(2.1±1.8)歲;體重 7～28 kg,平均體重(13±8)kg;病種為室間隔缺損 31例,房間隔缺損 9例;以上病例均無伴發(fā)血液系統(tǒng)、肝腎等系統(tǒng)疾病,術(shù)前無感染及免疫系統(tǒng)異常,無非甾體類抗炎藥、激素、免疫調(diào)節(jié)劑用藥史。麻醉誘導(dǎo)予以氯胺酮、芬太尼,均采用氣管插管靜脈及吸入復(fù)合麻醉,麻醉維持予以芬太尼、異丙酚和安氟醚。所有患兒均采用胸骨正中切口,常規(guī)主動(dòng)脈及上下腔靜脈插管建立 CPB,采用美國(guó) Sarns-8000人工心肺機(jī),美國(guó)Dideco膜式氧合器和寧波菲拉爾微栓過濾器。血定安、復(fù)方氯化鈉溶液預(yù)充,轉(zhuǎn)機(jī)前肝素化抗凝(3 mg/kg),CPB中追加肝素,保持激活全血凝固時(shí)間(ACT)＞480 s。血液中度稀釋,淺中度降溫。動(dòng)脈流量 80～150ml?m in-1?kg-1,CPB中維持平均動(dòng)脈壓 40～60mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。改良 St.Thomas晶體心肌保護(hù)液間斷主動(dòng)脈根部灌注。停機(jī)后按1∶1用量以魚精蛋白中和肝素。術(shù)后根據(jù)病情輸去白懸浮紅細(xì)胞和新鮮冷凍血漿,全組患者未出現(xiàn)死亡及二次開胸止血的情況。升主動(dòng)脈阻斷時(shí)間 13～68min;平均(28±13)m in;CPB時(shí)間 36～115m in,平均(49±26)m in。

1.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè) 分別于麻醉誘導(dǎo)后 10 min(T1),CPB后 30m in(T2),CPB停機(jī)即刻(T3),CPB后 2 h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取橈動(dòng)脈血。分別予以 CD 62P單克隆抗體(美國(guó)PHARMINGEN公司),CD 40L單克隆抗體(美國(guó) Ancell公司)標(biāo)記血小板后加入熒光二抗,采用流式細(xì)胞分析技術(shù)上機(jī)(美國(guó) BD公司 FACS420型流式細(xì)胞儀)各檢測(cè) 20 000個(gè)血小板,利用HP-300Consort 30計(jì)算機(jī)細(xì)胞分析軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(MFI)進(jìn)行資料采集和分析。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(美國(guó) RB公司)應(yīng)用意大利西亞克公司的ALISAI酶免自動(dòng)分析儀,測(cè)量血清 TNF-α。于術(shù)后24 h統(tǒng)計(jì)患者縱隔引流總量,結(jié)果以每千克體重出血毫升數(shù)(ml/kg)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析和Pearson直線相關(guān)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

T2血小板膜表達(dá) CD 40L已比 CPB前明顯升高(P＜0.01),在 T3時(shí)達(dá)到峰值,隨后開始下降,T6時(shí)恢復(fù)到 CPB前水平(P＞0.05)。CD62P在 T2時(shí)明顯升高(P＜0.01),在 T3時(shí)達(dá)到峰值,T6時(shí)回到基線水平(P＞0.05),在CPB前后所測(cè)定的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,它的表達(dá)量和相同時(shí)間點(diǎn)的 CD 40L均呈正相關(guān) (r值 分別為 0.563、0.657、0.691、0.580、 0.575和0.448,P＜0.05)。血漿 TNF-α在 CPB后開始升高,T3時(shí)達(dá)到峰值,與T1比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),隨后開始下降。TNF-α峰值與 CD 40L峰值呈正相關(guān)(r=0.577,P＜0.01)。術(shù)后 24h縱隔引流量為 4.88～15.46m l/kg,平均(9.7±2.7)m l/kg;24h縱隔引流量和 CD 40L峰值呈正相關(guān)(r=0.610,P＜0.01)。見表 1。

表1 CPB中不同時(shí)間血小板膜表達(dá)CD 40L和CD62P與血漿TNF-α濃度比較n=40,±s

表1 CPB中不同時(shí)間血小板膜表達(dá)CD 40L和CD62P與血漿TNF-α濃度比較n=40,±s

注：與T 1比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

項(xiàng)目 T1 T 2 T3 T4 T5 T6 CD40L(MFI) 1.8±0.4 4.3±0.9＊ 6.5±1.6# 5.7±1.4# 4.5±1.2# 1.9±0.4 CD62P(MFI) 1.6±0.4 3.8±0.8# 5.6±1.3# 5.1±1.2# 3.9±0.8# 1.7±0.3 TNF-α(pg/m l) 4.5±0.3 9.2±1.1＊ 16.9±1.2# 15.6±1.2# 13.9±1.1# 12.8±1.0

3 討論

CD40L是一種跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族,研究表明人體內(nèi) CD 40L及其血漿可溶產(chǎn)物sCD 40L的來源主要為激活后的血小板[2-4]。血小板活化后其顆粒內(nèi)容物之一的 α顆粒膜與血小板質(zhì)膜融合并迅速在血小板膜表面上大量表達(dá)的 CD 62P是血小板活化的特異標(biāo)志[5]。血小板激活是體內(nèi)多種復(fù)雜條件互相影響、互相聯(lián)系的一個(gè)結(jié)果,CD 62P和 CD40L存在位置和激活條件不同,所以不同條件下血小板被激活后表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量和方式可能有差異[6]。CPB是一種非生理環(huán)境下的治療手段,引起大量的血小板激活[7]。本試驗(yàn)中 CPB時(shí)CD62P的表達(dá)在時(shí)間規(guī)律上和 CD 40L完全相同,在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)上直線相關(guān)分析均呈正相關(guān)(P＜0.05)。說明 CPB由于異物表面、剪切力等原因引起的由 CD62P代表的血小板激活和CD40L的外化過程幾乎是同步進(jìn)行的,且這種過程一直持續(xù)到術(shù)后早期。所以我們認(rèn)為 CPB時(shí)血小板膜 CD40L可以和CD62P一樣作為血小板一種標(biāo)志物而反映血小板的激活情況。

CPB時(shí)血液的破壞、缺血再灌損傷、手術(shù)創(chuàng)傷、補(bǔ)體激活、內(nèi)毒素釋放等原因致使體內(nèi)大量炎性介質(zhì)的釋放導(dǎo)致全身炎性反應(yīng),這是CPB術(shù)后一系列并發(fā)癥包括多器官功能衰竭的病理基礎(chǔ)[8]。TNF-α是一種主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,可以由于CPB而大量釋放從而介導(dǎo)炎性反應(yīng),且其與血漿中 TNF-α的水平呈正相關(guān)(P＜0.01),可通過監(jiān)測(cè)血漿中TNF-α水平來間接反映全身炎癥狀況的程度[9]。本研究中發(fā)現(xiàn) TNF-α峰值與 CD40L峰值之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.577,P＜0.01),說明 CD 40L并不僅僅是血小板激活的標(biāo)志物,可能對(duì)于 CPB術(shù)后全身炎性反應(yīng)起作用,而且也可以象 TNF-α一樣對(duì) CPB所導(dǎo)致的全身炎性反應(yīng)、術(shù)后的并發(fā)癥作出一定的預(yù)測(cè),這為研究CPB引起的全身性炎癥、血栓反應(yīng)的機(jī)制及有針對(duì)性的采取治療措施提供了一個(gè)新的思路。CD 40L或 sCD40L通過結(jié)合血小板自身表達(dá)的GPⅡb/Ⅲa從而引起血小板聚集,是穩(wěn)定血小板血栓和導(dǎo)致血小板自身激活的活性物質(zhì)[10]。CPB所導(dǎo)致的并發(fā)癥除了可由炎性反應(yīng)引起外,還有很大一部分是由于凝血功能異常所導(dǎo)致,所以CPB圍術(shù)期的腦損傷、心肌損傷可能也與此有關(guān),而且由于血小板數(shù)量減少和功能異常引起術(shù)后出血。本研究中發(fā)現(xiàn) CD 40L峰值和 24h引流量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.610,P＜0.01),從而我們推測(cè)CPB導(dǎo)致血小板激活引起的凝血功能障礙中 CD 40L可能是其中一個(gè)環(huán)節(jié),其部分作用是通過 CD 40L和血小板互相作用來實(shí)現(xiàn)的。

我們的研究則描述了CPB過程中CD40L的動(dòng)態(tài)變化并初步揭示了其和 CD 62P代表的血小板激活之間聯(lián)系,而且還發(fā)現(xiàn) CPB中血小板表達(dá) CD40L的高低和全身炎性反應(yīng)標(biāo)志物TNF-α及術(shù)后縱隔引流量都呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),說明血小板可能就是通過 CD40L系統(tǒng)成為聯(lián)系這兩個(gè)過程的紐帶,對(duì)它深入研究將對(duì)理解CPB導(dǎo)致機(jī)體損傷的病理生理學(xué)機(jī)制,從而為有針對(duì)性的采取更好的措施預(yù)防和治療 CPB引起的出血、炎癥并發(fā)癥,提高手術(shù)效果和安全性起到積極的作用。但本試驗(yàn)僅從大體上作了CPB對(duì)血小板激活引起CD40L的表達(dá)規(guī)律及其和 CD 62P、TNF-α、術(shù)后出血量的關(guān)系分析,并未在更深入的層次上研究它們的相互作用關(guān)系及其機(jī)制。而且出于對(duì)誤差控制的考慮,選取的病例病種較為單一且病情較輕。

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The effect of cardiopu lmonary bypass in the exp ression o f CD 40 ligand on p lateletmembrane

GONG Qi, TAN Lingling,LINWei,eta l.Departmentof Thoracic and Cardiovascu lar Surgery,The Fourth Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050011,China

Objective To observe the effect of cardiopulmonary bypass(CPB)in the expression of CD40 ligand(CD40L)on p lateletsmembrane,and to investigate the correlation between platelet stimulation,systemic inflammation and coagulation.M ethods 40 patients undergoing open heart operation by CPB were studied.Blood samp leswere collected from peripheral arterial 10 minutes after anesthesia induction(T1),30minutes after CPB(T2),instant on the termination of CPB(T3),after 2 hours(T4),4 hours(T5),8 hours and at the term ination of CPB(T6).The expression of CD 40L and CD 62P on plateletmembrane,plasma TNF-αconcentration,totalamount of bleeding after 24-hour CPB were detected.Resu lts The expression levels of CD 40L on plateletmembrane were significantly increased after CPB(P＜0.01),which reached its peak at the term ination of CPB and returned to the baseline after 8 hours.The CD 40L was significantly correlated with CD 62P,TNF-αand the amount of bleeding respectively(P＜0.01).Conclusion The expression of CD40L on plateletmembrane increaseswith the p lateletactivation caused by CPB.The platelet-derived CD 40Lmay be involved in both the thrombotic and inflammatory events accompanied with CPB.

cardiopulmonary bypass;p latelet;CD 40L;comp lications

R 654.1

A

1002-7386(2010)07-0797-03

050011 石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸心外科

2009-12-14)