叢明柱 張 敏

近年來，國內(nèi)外掀起了利用紅曲開發(fā)保健食品的熱潮，對(duì)紅曲霉中功能因子的分子結(jié)構(gòu)和安全性等方面展開了廣泛而深入的研究。紅曲霉制劑被廣泛應(yīng)用于食品著色上。紅曲霉與中藥合生素在動(dòng)物生產(chǎn)上的研究報(bào)道很少，特別是對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境影響的報(bào)道更少。本試驗(yàn)使用的健胃中藥含有機(jī)酸，能提供瘤胃微生物代謝所需的中間產(chǎn)物，能調(diào)節(jié)胃腸內(nèi)的pH值，防止有害細(xì)菌的繁殖。紅曲霉中含多種活性酶和可提供瘤胃微生物擴(kuò)繁的活性肽，可促進(jìn)瘤胃內(nèi)氨氮的吸收利用。本文旨在研究紅曲霉與中藥合生素對(duì)延邊黃牛瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響，為開發(fā)育肥牛新型飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 紅曲霉?jié)穹鄣闹谱?/h3>

將蒸熟的大米裝入平皿內(nèi)，約0.5～0.7 cm，高壓滅菌25 min，同時(shí)用一只三角瓶內(nèi)裝0.2%的冰乙酸溶液少許，裝入大米的平皿冷卻后取斜面試管中紫色紅曲霉(M.purpureus)5～8 次注入到 10～20 ml的 0.2%的冰乙酸溶液中，取1 ml接入到大米培養(yǎng)基內(nèi)，于32℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d。

烘干：將培養(yǎng)好的紅曲霉?jié)窳蠑側(cè)肴萜鲀?nèi)，放入55℃的烘箱內(nèi)，干燥12～14 h即可，然后粉碎制成粉狀。

1.2 紅曲霉+中藥合生素的制備

將山藥、神曲、山楂、紅棗和紅曲霉菌塊分別粉碎，采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的微量混合機(jī)混合均勻備用。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)牧場完成。選擇6頭25月齡左右、健康、體重相近[(325±25)kg]、體況良好、安裝永久性瘤胃瘺管的延邊黃牛母牛。

1.4 飼養(yǎng)管理

所有供試牛在試驗(yàn)前驅(qū)除體內(nèi)、體外寄生蟲，并且口服健胃散健胃。每天分兩次飼喂（8:00和16:00），自由飲水，常規(guī)光照。飼喂前將精料與粗料混合均勻。每次飼喂后，清掃牛舍，保持牛體表的清潔，保證牛有清潔、干凈的飲水和休息環(huán)境。牛入舍前，舍內(nèi)及器具均徹底消毒。預(yù)飼期讓牛逐漸適應(yīng)新的環(huán)境和飼養(yǎng)管理方式，在此期間精料的喂量由少到多。試驗(yàn)中經(jīng)常刷拭牛體，保持牛體清潔，被毛柔順。定期放開運(yùn)動(dòng)。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3×3完全拉丁方設(shè)計(jì)?；A(chǔ)日糧飼喂量由精料補(bǔ)充料、玉米青貯料組成，日糧精粗比為36：64。試驗(yàn)分為A、B、C三組。每組基礎(chǔ)日糧組成一致，首先A組飼喂基礎(chǔ)日糧，B組飼喂基礎(chǔ)日糧加0.5%紅曲霉，C組飼喂基礎(chǔ)日糧加紅曲霉+中藥合生素制劑0.5%輪換飼喂。精料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.6 瘤胃液的采集與處理

試驗(yàn)分三期，每期12 d，每期試驗(yàn)第10 d于早晨8:00飼喂前采集瘤胃液作為0 h樣品進(jìn)行分析，同時(shí)按飼喂后每隔3 h采集一次，即3、6、9 h分別采集樣品。從瘤胃前、中、后部位采樣，盡量使采樣均勻。各時(shí)間點(diǎn)分別采集瘤胃液300 ml，在測定各項(xiàng)指標(biāo)前于－25℃保存。

表1 供試牛日糧精料組成及營養(yǎng)水平

1.7 測定項(xiàng)目與方法

1.7.1 pH值的測定

采樣后，四層紗布過濾，用PHS－3C型酸度計(jì)（蕭山市分析儀器廠，復(fù)合電極）直接測定。

1.7.2 瘤胃原蟲計(jì)數(shù)

將瘤胃液用2層醫(yī)用紗布過濾后，立即用移液槍取1 ml瘤胃液置于試管(避光，錫箔包裹)中，加4 ml MFS染色液(35%福爾馬林100 ml，氯化鈉8.0 g，甲基綠0.6 g，混合后定容至1000 ml)，即將樣品稀釋5倍，搖勻，靜置30 min以上，用吸管(管口徑大于1 mm)將搖勻的樣品稀釋液以連續(xù)不斷的液流充滿血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察(5×40)。計(jì)算公式：

式中：N——所有方格中纖毛蟲的總數(shù)；

D——稀釋倍數(shù)；

10000——0.1 mm3換算為1 ml時(shí)的倍數(shù)。

1.7.3 NH3－N 的測定

將瘤胃液在3000 r/min離心15 min，取上層液1 ml保存在1.5 ml的微型離心管內(nèi)，然后放于－20℃冰箱內(nèi)冷凍保存。根據(jù)Chaney等（1962）的方法，利用分光光度計(jì)在630 nm下測定吸光度后計(jì)算。

1.7.4 菌體蛋白(BCP)的測定

菌體蛋白測定參照Cotta等(1982)和Broderick等(1989)闡述的差速離心法進(jìn)行。瘤胃液經(jīng)兩層紗布過濾后，取30 ml經(jīng)四層紗布過濾的瘤胃液于50 ml離心管中，低速1000 r/min離心10 min去除原蟲和飼料大顆粒，之后準(zhǔn)確量取20 ml裝于高速離心管中4℃下13000 r/min離心20 min，以分離出細(xì)菌，棄上清液，用0.9%的氯化鈉溶液洗滌，再13000 r/min離心20 min，棄掉上清液，重復(fù)2次。棄上清液后，借助玻璃棒小心無損地將高速離心的細(xì)菌沉淀轉(zhuǎn)移到消化管中，用凱氏定氮法測定BCP的含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)pH值的影響(見表 2、圖 1)

表2 瘤胃液pH值的變化

圖1 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃pH值的影響

各試驗(yàn)組的 pH值在 6.59～7.12，Kopecny和 Wallace(1982)建議適合瘤胃微生物蛋白水解酶活性作用的pH值為5.6～7.5，屬于正常變動(dòng)范圍內(nèi)。而且從采食后各時(shí)間點(diǎn)與平均值可見各試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)NH3－N濃度的影響（見表3、圖2）

表3 NH3－N 濃度的變化（mg/100 ml）

從表3、圖2可以看出，試驗(yàn)中各組氨態(tài)氮濃度呈先上升后下降后略有回升的趨勢，濃度變化范圍為9.34～14.20 mg/100 ml。Slyter（1979）認(rèn)為，NH3－N濃度最佳范圍是0.35～29 mg/100 ml，這表明牛瘤胃內(nèi)NH3－N濃度均處于合成瘤胃微生物的最佳濃度范圍內(nèi)。從表3可以看出，NH3－N濃度紅曲霉+中藥組在3、6、9 h 與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），紅曲霉組在 6、9 h與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），都高于對(duì)照組，分別高出 10.76%、40.47%、12.17%，38.22%、26.16%。

圖2 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃NH3－N濃度的影響

2.3 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量的影響（見表 4、圖 3）

表4 瘤胃液中纖毛蟲數(shù)量的變化（×105個(gè)/ml）

圖3 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量的影響

由表4可知，對(duì)照組、紅曲霉組和紅曲霉+中藥組在采食3 h后纖毛蟲數(shù)量有下降的趨勢，至采食6 h后開始逐漸回升。這可能是由于此時(shí)瘤胃pH值逐漸降低，瘤胃內(nèi)環(huán)境的變化引起所致。其中6 h時(shí)紅曲霉+中藥組與對(duì)照組、紅曲霉組相比分別低25.66%、18.74%，差異顯著（P＜0.05）。其它時(shí)間差異不顯著。

2.4 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成量的影響（見表5、圖4）

表5 BCP濃度的變化（mg/100 ml）

圖4 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)（BCP）合成量的影響

由圖4可見，飼喂后各組BCP含量均呈先上升后下降的趨勢。從表5可以看出飼喂后3 h紅曲霉組和紅曲霉+中藥組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。6～9 h紅曲霉+中藥組與其它兩組差異顯著（P＜0.05）。而紅曲霉+中藥組在飼喂6、9 h內(nèi)的值顯著高于其它兩組（P＜0.05）。分別高出 16.30%、10.16%；12.17%、8.27%。其變化范圍在18.69～24.20 mg/100 ml。

3 討論

3.1 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃pH值的影響

pH值是反映瘤胃發(fā)酵水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)，綜合反映瘤胃微生物、代謝產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)生、吸收、排出及綜合狀況。它直接受唾液分泌、揮發(fā)性脂肪酸及其它有機(jī)酸生成、吸收和排出等因素的影響，引起瘤胃pH值波動(dòng)的根本原因則是日糧結(jié)構(gòu)和日糧營養(yǎng)(Reddy,1987)。韓正康和Murphy等指出，瘤胃內(nèi)pH值有規(guī)律的變動(dòng)，取決于飼糧性質(zhì)和攝食時(shí)間，一般飼喂后2～6 h達(dá)到最低值。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組pH值隨時(shí)間的變化趨勢大致與此相同。各試驗(yàn)組的pH值在6.59～7.12，Kopecny 和 Wallace(1982)建議適合瘤胃微生物蛋白水解酶活性作用的pH值為5.6～7.5。本試驗(yàn)中。各組pH值變化規(guī)律與預(yù)期相同，且在正常范圍內(nèi)，對(duì)照組和試驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)pH值變化均不顯著，說明飼喂紅曲霉+中藥合生素不影響瘤胃pH值。

3.2 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃NH3－N濃度的影響

NH3－N濃度在一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3的速度及其對(duì)NH3的攝取利用情況，反映了在特定日糧組成下，蛋白質(zhì)降解與合成之間所達(dá)到的平衡（McDonald，1988）。Slyter（1979）認(rèn)為，NH3－N 濃度最佳范圍是 0.35～29 mg/100 ml。從表3可以看出，試驗(yàn)中NH3－N濃度變化范圍為9.34～14.20 mg/100 ml,這表明牛瘤胃內(nèi)NH3－N濃度均處于合成瘤胃微生物的最佳濃度范圍內(nèi)。紅曲霉+中藥組在 3、6、9 h，紅曲霉組在 6、9 h NH3－N 濃度都顯著高于對(duì)照組。這是因?yàn)椋弘S著進(jìn)食，紅曲霉+中藥組為微生物提供了必要的營養(yǎng)，飼料蛋白分解加快，使其NH3－N濃度略高，但隨著氨在瘤胃內(nèi)被微生物利用和瘤胃壁吸收，濃度逐漸下降，到達(dá)9 h后又趨于平衡狀態(tài)。這與Okeke等(1983)得出的結(jié)果相同。

3.3 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量的影響

原蟲在反芻動(dòng)物的營養(yǎng)代謝方面占據(jù)很重要的位置，它是瘤胃微生物區(qū)系不可或缺的正常組分。瘤胃纖毛蟲的種類和種群數(shù)量依據(jù)宿主的飼喂條件、生理等因素的變化而發(fā)生變化，因此，根據(jù)這種變化，可將其作為衡量瘤胃環(huán)境狀況的一個(gè)指標(biāo)。本試驗(yàn)可以看出對(duì)照組、紅曲霉組和紅曲霉+中藥組在采食3 h后有下降的趨勢，至下次飼喂前回升。這可能是由于此時(shí)瘤胃pH值逐漸降低，瘤胃內(nèi)環(huán)境的變化引起所致。其中6 h時(shí)紅曲霉+中藥組與對(duì)照組、紅曲霉組相比差異顯著（P＜0.05）。紅曲霉+中藥組略低于紅曲霉和對(duì)照組（P＜0.05）。其它時(shí)間差異不顯著。

3.4 飼喂紅曲霉+中藥合生素對(duì)瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)（BCP）合成量的影響

BCP主要是由細(xì)菌利用飼料中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的NH3作為氮源，利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸作為能源而合成的。因此BCP合成的數(shù)量間接反映了細(xì)菌的活性及數(shù)量。本試驗(yàn)中可見，飼喂后3 h紅曲霉組和紅曲霉+中藥組與對(duì)照組BCP差異顯著（P＜0.05）；6～9 h紅曲霉+中藥組與其它兩組差異顯著（P＜0.05）。其變化范圍在 18.69～24.20 mg/100 ml。在各處理組中，中藥+紅曲霉組BCP水平普遍較高，說明細(xì)菌充分利用氨合成了BCP。Jounay等（1999）報(bào)道由于對(duì)纖毛蟲的抑制作用，導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌利用氨合成菌體蛋白的能力增強(qiáng)。紅曲霉+中藥組對(duì)纖毛蟲有輕微的抑制作用，這也是導(dǎo)致瘤胃細(xì)菌利用氨合成菌體蛋白的量增加的原因之一。

4 結(jié)論

紅曲霉+中藥組可以改善瘤胃的內(nèi)環(huán)境，具有明顯促進(jìn)菌體蛋白合成、抑制纖毛蟲生長的作用，提高其對(duì)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。

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