郭慧 韓錦華 李東波 李曉明

信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcri-ption, STAT)是一類由細胞因子、生長因子、非受體類酪氨酸激酶等細胞外信號激活的轉(zhuǎn)錄因子[1]，在基因治療領(lǐng)域里，RNA干擾(RNA interference，RNAi)由于其具有高效性和高度特異性，是近年來基因組學研究的熱點，正逐漸發(fā)展成為關(guān)閉特定基因功能的關(guān)鍵技術(shù)[2]。頭頸鱗癌是常見的惡性腫瘤，針對其生長速度快、侵襲力強，對放化療的敏感性低、抵抗力強的特點，本實驗應用RNAi技術(shù)沉默STAT3基因，從對喉鱗癌細胞增殖的影響了解STAT3與喉鱗癌生物學行為和化療抵抗關(guān)系及機理。

1 材料與方法

1.1 材料 重組質(zhì)粒構(gòu)建與試劑，我們的前期工作已經(jīng)成功合成與純化出重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/NeoshSTAT3(STAT3-siRNA),經(jīng)DNA測序鑒定，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，人鱗狀喉癌細胞株hep-2培養(yǎng)在完全RPMI medium 1640。MTT為Sigma公司產(chǎn)品。

脂質(zhì)體Lipofectamine 2000由invitrogen corporation 生產(chǎn)，兔抗人STAT3抗體。

1.2 方法研究

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 HEP-2細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于培養(yǎng)瓶，細胞融合達40%～60%時分為五組進行轉(zhuǎn)染(1)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陰性對照組；(2)脂質(zhì)體組；(3)DDP組；(4)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA組；(5)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA+DDP。其中DDP組加DDP(濃度4μg/ml[3])，STAT3-siRNA+DDP組先加STAT3-siRNA，6h后加DDP(濃度4μg/ml)。

1.2.2 細胞增殖狀態(tài)檢測 用MTT法。 接種HEP-2細胞于96孔板，貼壁后，無血清培養(yǎng)16～24h，實驗組分別加入陰性對照質(zhì)粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP(濃度4μg/ml)。第0、1、2、3天分別加入MTT 5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入甲200μl，酶標儀測定490nm吸光度值，繪制生長曲線。

1.2.3 細胞周期檢測 無血清培養(yǎng)細胞16～24h，實驗組分別加入陰性對照質(zhì)粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分別消化細胞，PBS重懸，70%冰乙醇固定，37℃水浴1h，加入PI，4℃避光染色1h，流式細胞儀檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測蛋白的表達 無血清培養(yǎng)細胞16～24h，實驗組分別加入陰性對照質(zhì)粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分別消化細胞，PBS重懸，4%多聚甲醛固定，冰浴，分別加入相應的一抗、二抗，避光冰浴40min，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較采用方差分析、t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3-siRNA增強了DDP對Hep-2細胞的增殖抑制作用 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，DDP組表現(xiàn)出一定的增殖抑制效應，重組質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后24h開始表現(xiàn)出一定的增殖抑制效應，72h表現(xiàn)出明顯的抑制效應，STAT3-siRNA重組質(zhì)粒加化療組能顯著抑制Hep-2細胞的增殖活性，細胞出現(xiàn)了生長抑制現(xiàn)象，與STAT3-siRNA組、DDP組、脂質(zhì)體對照組和陰性對照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(見表1)

2.2 STAT3-siRNA增強了DDP對Hep-2細胞周期的阻滯作用 STAT3-siRNA與DDP作用于Hep-2細胞72h后，G1期細胞比率由54.1%上升至73.0%，S期細胞比率由32.5%下降至6.9%。STAT3-siRNA組、脂質(zhì)體組、DDP組、陰性對照組細胞S期比例在20.9%～32.4%之間。STAT3-siRNA+DDP組73.0%的細胞阻滯于G0/G1期，高于其余四組(P＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。(見圖1)

2.3 STAT3-siRNA與DDP對STAT3信號轉(zhuǎn)導通路成員表達的影響 重組質(zhì)粒與DDP作用于喉癌Hep-2細胞72h后，p-STAT3蛋白表達與活性下調(diào)，其靶基因產(chǎn)CyclinD1表達下降。經(jīng)兩樣本均數(shù)比較的方差分析，重組質(zhì)粒加DDP組p-STAT3、CyclinD1的蛋白表達熒光指數(shù)(1.276±0.195，1.336±0.142)明顯低于其余四組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(見表2)

3 討論

化學治療又稱抗癌藥治療，目前臨床上對于中、晚期惡性腫瘤常應用化療輔助手術(shù)及放療。順鉑是喉癌中晚期轉(zhuǎn)移患者化療的主要一線藥物，因其單藥總有效率不高，尤其以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案對喉癌的總有效率仍未見明顯提高[4]，故尋找有效的方法和試劑提高順鉑治療作用，對改善喉癌的療效意義極其重大。

本次實驗中應用流式細胞技術(shù)檢測，我們觀察到STAT3-siRNA重組質(zhì)粒與DDP作用于Hep-2細胞72h后，p-STAT3蛋白表達與活性下調(diào)，其靶基因產(chǎn)物CyclinD1表達下降，而化療組和陰性對照細胞中上述指標無明顯變化，說明STAT3基因的沉默可以抑制STAT3的表達從而起到對順鉑增敏的作用。通常STAT3對細胞周期的調(diào)控作用主要表現(xiàn)為對基因Cyclin D1、c-Myc、Pim等的調(diào)控，過度表達Cyclin D1可以調(diào)節(jié)細胞周期前進，加快腫瘤細胞的增殖速度[5]。本次實驗中，我們使用STAT3-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細胞6小時后，加入4μg/ml濃度DDP，培養(yǎng)24h、48h、72h后，MTT法檢測各組細胞的生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3-siRNA重組質(zhì)粒加化療組能顯著抑制Hep-2細胞的增殖活性，細胞出現(xiàn)了生長抑制現(xiàn)象，與STAT3-siRNA組、陰性對照組和脂質(zhì)體對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義，說明Hep-2細胞在封閉STAT3基因后抑制了Cyclin D1的作用，由對順鉑耐藥狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閷樸K敏感。同時，流式細胞儀檢測結(jié)果也顯示，聯(lián)合應用STAT3-siRNA重組質(zhì)粒和化療的細胞進入G0/G1期的細胞數(shù)較其余四組細胞有明顯增加，同時S期細胞數(shù)明顯減少；增殖指數(shù)PI下降，DNA合成期縮短，表明STAT3-siRNA與DDP聯(lián)合作用于喉鱗癌Hep-2細胞后，細胞G1期阻滯明顯，細胞增殖抑制作用增加。

表1 對喉癌Hep-2細胞的抑制率

圖1 FCM was used to show the cell cycle of Hep-2 cells transfected with STAT3 siRNA+DDP after 72h(a:Control; b:Liposome; c:DDP;d:STAT3-siRNA; e:STAT3 siRNA+DDP)

表2 p-STAT3, Cyclin D1的表達

通過本次實驗我們發(fā)現(xiàn)，STAT3-siRNA重組質(zhì)粒具有增強化療抑制腫瘤細胞生長的作用，是增強化療敏感性的一個潛在的分子靶位點，有可能在不改變化療藥物劑量前提下，增加藥物療效。RNAi技術(shù)的治療效果在逆轉(zhuǎn)喉鱗癌化療耐藥中的有效性得到證實，加深了人們對化療抗性基因水平機制的了解，為我們在基因水平上改變腫瘤細胞的化療敏感性提供了線索。

[1]Levy DE,Darnell JE.STATs transcriptional control and biological impact[J].Nat Rev Mol cell biol,2002,3(9):651-662.

[2]Aimee LJ,Peter SL.Noise amidst the silence:off-target effects of siRNAs[J].TRENDS in Genetics,2004,20(11):521.

[3]王俊閣,李曉明,陳英會,等.信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3反義寡核苷酸聯(lián)合化療調(diào)控喉癌細胞增殖與凋亡的分子機制[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,42(3):222-226.

[4]張梅春,趙子文,劉朝暉,等.重組人可溶性凋亡配體相關(guān)蛋白聯(lián)合順鉑抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長[J].實用醫(yī)學雜志,2007,23(3):301-303.

[5]Niu G.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis.Oncogene,2002,21(13):2000-2008.