朱 玉，楊菊紅，王 楠，李 冰，王 巍，趙榮蘭，梁東春，馮 憑

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院代謝病科，天津 300052；2.天津內(nèi)分泌研究所）

目前，在世界范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病呈流行趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅人類健康的全球性公共健康問(wèn)題。糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者的主要伴發(fā)病和首要死亡原因，深入研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制并予以積極的治療成為目前醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的問(wèn)題[1]。組蛋白去乙酰化酶（SIRT）1是近年發(fā)現(xiàn)的與衰老、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)的核蛋白，最近的研究還發(fā)現(xiàn)其在維持血管正常功能中具有重要的作用。本研究以自發(fā)性2型糖尿病模型——OLETF大鼠及其同系非糖尿病LETO對(duì)照大鼠為研究對(duì)象，觀察兩者腹主動(dòng)脈SIRT1的表達(dá)情況，以探討SIRT1在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO鼠由日本大冢制藥株式會(huì)社德島研究所引進(jìn)。大鼠皆為雄性，OLETF 30只，4周齡，至30周時(shí)，共有成模OLETF鼠20只。LETO大鼠10只為正常對(duì)照組。

大鼠在無(wú)特定病原體級(jí)（SPF級(jí)，specific pathogen-free)條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料。環(huán)境溫度控制在22～25℃,濕度為（55±5）%，12/12h光照黑暗循環(huán)（光照時(shí)間7:00-19:00），自由獲取食物和飲水。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 國(guó)產(chǎn)分析純，滅菌分裝，室溫保存；TRIZOL試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（美國(guó)Fermentas公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó) Invitrogen公司）；TaqDNA聚合酶、dNTPs、SYBR?Green PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；DNA凝膠回收試劑盒（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司）；鹽酸二甲雙胍片（天津太平洋制藥有限公司，常溫保存，臨用前蒸餾水稀釋）；Authorized Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀（英國(guó)Hybaid公司）；DNA Thermal Cycler 480擴(kuò)增儀（美國(guó)Perkin Elmer Cetus公司）；PTC-200梯度PCR儀（美國(guó)MJ Research公司）；DH-2000凝膠圖像采集分析系統(tǒng)、SORVALL? LEGEND RT臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；紫外透射儀（瑞典LKB公司）；Bio Photometer分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司）；Real-timePCR儀Light Cycler（瑞士Roche公司）；電泳儀（大連競(jìng)邁公司）；德國(guó)內(nèi)卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析儀；日立-7150全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠42周行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)[2]。

1.2.2 動(dòng)物分組及藥物處理 實(shí)驗(yàn)期間取血意外死亡動(dòng)物5只，其中OLETF 3只，LETO 2只。OLETF鼠17只，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組，LETO鼠8只為空白對(duì)照組。治療組大鼠，每日以二甲雙胍溶液（臨用前攪拌至完全溶解，以蒸餾水稀釋）3mg/kg體重灌胃，其余大鼠均以同體積的蒸餾水灌胃，每日1次，共12周。

1.2.3 樣本取材 各組禁食14h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（40mg/kg），處死大鼠，迅速取出腹主動(dòng)脈，小心去除外膜結(jié)締組織，置于凍存管中，于液氮罐中速凍2h，-80℃低溫冰箱保存。

1.2.4 基因的REAL-TIME PCR產(chǎn)物定量測(cè)定 取-80℃冰箱冰凍保存標(biāo)本約50～100mg，浸泡于1ml TRizol中，勻漿30s后，移入1.5ml Eppendorf管中，－20℃靜置5min；按每1ml TRizol加入氯仿0.2ml，蓋緊管蓋，翻轉(zhuǎn)充分混勻，－20℃靜置15min；12000r/min，4℃離心15min；小心吸取上層水相于新的1.5ml Eppendorf管中，加入等體積異丙醇，充分混勻冰上30min；12000r/min，4℃離心10min；吸棄上清，加入冰預(yù)冷的75%乙醇（DEPC處理過(guò)的水配置）1ml，輕輕吹打徹底漂洗，7500r/min，4℃離心5min；吸棄上清，沉淀于超凈工作臺(tái)內(nèi)室溫干燥。30μl DEPC處理過(guò)的雙蒸水溶解RNA，55～60℃水浴中助溶（<10min），鑒定總RNA濃度、純度和完整性。2μg總RNA于20μl反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈，然后以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。上游引物5′-TTTCAGAACCACCAAAGCG-3′；下游引物5′-TCCCACAGGAAACA GAAACC-3′。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃5s、58℃20s、72℃6s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。溫度變化速度為20℃/s，在每個(gè)循環(huán)的延伸末檢測(cè)熒光信號(hào)。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序，循環(huán)參數(shù)：95℃0s，65℃15s，95℃0s，溫度變化速度為0.1℃/s。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，以核酸分子量標(biāo)志物DL-2000為參照，估算擴(kuò)增產(chǎn)物大小，同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示,多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹主動(dòng)脈中總RNA的提取 提取組織總RNA在分光光度計(jì)上檢測(cè)，其OD260/OD280均介于1.7～2.0之間，OD260/OD 230介于1.5～1.9之間，說(shuō)明總RNA純度較好，基本去除了DNA、蛋白質(zhì)和糖類等其它大分子物質(zhì)的污染。總RNA在1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，均可以看到清晰的18s與28s兩個(gè)條帶的光密度比值約為2，說(shuō)明提取的總RNA的完整性較好，基本無(wú)降解（圖1）。

2.2 大鼠腹主動(dòng)脈SIRT1mRNA REAL-TIME PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 SIRT1、GAPDH 2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA分子量大小為126bp及130bp左右的目的條帶（圖2）。

2.2.2 SIRT1、GAPDH擴(kuò)增曲線及融解曲線 Realtime PCR產(chǎn)物經(jīng)95℃0s，65℃15s，95℃0s(溫度轉(zhuǎn)換速率是0.1℃/s)進(jìn)行融解曲線分析。不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和大鼠腹主動(dòng)脈SIRT1擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度為86℃，GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度為83℃。沒(méi)有明顯的引物二聚體和非特異峰出現(xiàn)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性（圖3、4）。

2.2.3 不同組大鼠主動(dòng)脈SIRT1mRNA的表達(dá) 模型組SIRT1mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），使用二甲雙胍治療12周后SIRT1mRNA的表達(dá)較模型組明顯升高（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 大鼠主動(dòng)脈SIRT1mRNA的表達(dá)

3 討論

SIRT1是一種NAD+依賴的組蛋白去乙酰基蛋白酶，參與應(yīng)激狀態(tài)如空腹、饑餓時(shí)機(jī)體的適應(yīng)性代謝調(diào)節(jié)作用[3]。近期，Milne等[4]發(fā)現(xiàn)SIRT1激動(dòng)劑可改善肥胖糖尿病大鼠的胰島素敏感性，降低血糖，認(rèn)為SIRT1將是2型糖尿病一條新的有希望的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在血管內(nèi)皮的正常功能中具有重要作用[5-6]。而且在后續(xù)的研究中人們發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮特異性高表達(dá)SIRT1可以阻止apoE敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)該功能與SIRT1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活及功能的改善有關(guān)[7]。

本研究選取與人2型糖尿病發(fā)病過(guò)程相似的自發(fā)性2型糖尿病OLETF大鼠為模型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常同系LETO大鼠，糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈SIRT1的表達(dá)明顯下降（P<0.05），提示SIRT1的表達(dá)下降可能與糖尿病大血管病變相關(guān)。SIRT1下降如何參與了糖尿病大血管病變機(jī)制不明。意大利學(xué)者Cardellini等[8]最近發(fā)表的研究對(duì)60名2型糖尿病患者的頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其TIMP-3的水平明顯下降，且與SIRT1的表達(dá)下降明顯相關(guān)。由于TIMP-3是抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成的蛋白酶，因此SIRT1的表達(dá)下降可能使TIMP-3的表達(dá)下降而參與了糖尿病大血管病變的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)降低可能使其對(duì)p53表達(dá)的抑制作用降低，因而使細(xì)胞壽命縮短，從而促進(jìn)了糖尿病血管病變的發(fā)生[9]。

我們的研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)組腹主動(dòng)脈SIRT1的表達(dá)較模型組有明顯增加（P<0.05）。二甲雙胍改善SIRT1表達(dá)的機(jī)制不明，可能是大鼠血糖降低的間接作用。當(dāng)然也可能是二甲雙胍降糖以外的直接作用。眾所周知，二甲雙胍是通過(guò)激活A(yù)MPK而改善糖尿病患者的血糖的。AMPK是機(jī)體能量狀態(tài)的感受器，可以感知細(xì)胞ATP/AMP水平的變化，從而使細(xì)胞由合成代謝向分解代謝間轉(zhuǎn)換，以維持細(xì)胞的能量平衡。最新在《Nature》中發(fā)表的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK還可同時(shí)激活另一個(gè)能量感受器——SIRT1，后者能進(jìn)一步去乙?；疐OXO1、FOXO3a以及PPAR-γ等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝[10]。

總之，本研究提示SIRT1表達(dá)降低可能參與了2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，SIRT1在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化中具有潛在治療價(jià)值。

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