諶志筠，王 芳，李曉眠

（天津醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，天津 300070）

人副流感病毒（human parainfluenza virus，hPIV）根據(jù)遺傳學(xué)和血清學(xué)可分為4型，是兒童急性呼吸道感染（acute respiratory infection,ARI）的重要病原之一。全球每年都有不同亞型的hPIV交替流行[1-2]，其中Ⅰ型是引起嬰幼兒嚴(yán)重哮吼的主要病原，Ⅲ型引起的下呼吸道感染的發(fā)病率僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)[3-5]。近年來國(guó)內(nèi)也有相當(dāng)數(shù)量的報(bào)道顯示hPIV是我國(guó)各個(gè)地區(qū)嬰幼兒嚴(yán)重呼吸道感染的重要病因[6-7]。因此盡快找到防治hPIV的方法顯得十分重要。仙臺(tái)病毒Tianjin株（Sendai virus,strain Tianjin,SeV）是1999年從天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心爆發(fā)急性上呼吸道感染的普通棉耳狨猴肺臟中分離出來的毒株，經(jīng)鑒定屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬，與仙臺(tái)病毒親緣關(guān)系最近，不屬于仙臺(tái)病毒現(xiàn)有的3個(gè)進(jìn)化分支而自成獨(dú)立的一支[8-9]。仙臺(tái)病毒與人副流感病毒I型同屬副流感病毒I型，二者間有十分密切的抗原關(guān)系[10]。研究發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒減毒活疫苗能保護(hù)非洲綠猴免受hPIV-1的攻擊，而hPIV-1亦能保護(hù)幼鼠免受仙臺(tái)病毒的攻擊，這種親異特性模擬了仙臺(tái)病毒抗原成分保護(hù)嬰幼兒免受hPIV-1感染的可能性[11-12]。因此，本文通過仙臺(tái)病毒Tianjin株多克隆抗體及其HN基因、F基因真核表達(dá)質(zhì)粒免疫血清抗體與hPIV-1的血清中和實(shí)驗(yàn)，對(duì)開發(fā)新的hPIV-1異源性疫苗的可行性進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 Vero細(xì)胞、仙臺(tái)病毒Tianjin株（本教研室保存）；人副流感病毒I型（中國(guó)CDC病毒病預(yù)防控制所）；真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1（Invitrogen）；感受態(tài)大腸桿菌DH5α（寶生物），病毒RNA提取試劑盒(QIAGEN),逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen），限制性內(nèi)切酶HindⅢ/EcoRI（Promega），DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒（寶生物），寡核苷酸引物（北京奧科公司）；RPMI-1640（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；0.25%胰酶（Hyclone）；1%雞血紅細(xì)胞懸液（本實(shí)驗(yàn)室自制）；雞胚(天津市羽豐種雞場(chǎng))；3周齡昆明鼠（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院核醫(yī)學(xué)研究所）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠-Ig（Sigma），牛血清白蛋白（GIBCO）。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種與培養(yǎng) 選取9日齡健康雞胚尿囊腔接種SeV，0.3ml/胚，37℃培養(yǎng)48h后收集尿囊液，置于-70℃保存?zhèn)溆谩４齎ero細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后用PBS潤(rùn)洗3次，接種hPIV-1，病毒液接種量0.5ml/瓶，37℃吸附1h后，棄去多余病毒液，換維持液(RPMI-1640+2%FBS)，置于37℃培養(yǎng)72h收獲病毒。

1.2.2 仙臺(tái)病毒Tianjin株多克隆抗體的制備 實(shí)驗(yàn)前分別測(cè)定SeV和hPIV-1的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（median tissue culture infective dose,TCID50）。將SeV稀釋成100TCID50/0.1ml免疫小鼠5只，50μl/只，尾部、腹股溝、腋下、背部皮下等多點(diǎn)注射，每間隔

1周免疫1次，共免疫3次。3d后取血分離血清，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫血清抗體效價(jià)測(cè)定 SeV抗原（抗原最適工作濃度由棋盤滴定法滴定）包被酶標(biāo)板，2%BSA封閉后加待檢血清，37℃溫育1h，洗板5次，加入酶標(biāo)抗體再次37℃溫育1h，洗板后加底物顯色，SDS終止反應(yīng)后測(cè)定OD值。

1.2.4 中和實(shí)驗(yàn) 將 hPIV-1稀釋至100TCID50/ 0.1ml，分別與倍比稀釋的免疫血清等量混合，37℃水浴作用1h后，按血清稀釋度依次接種至已長(zhǎng)成致密單層Vero細(xì)胞的96孔板中，每稀釋度接種4個(gè)復(fù)孔，37℃吸附1h后換維持液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)，逐日觀察CPE，根據(jù)結(jié)果計(jì)算50%血清中和終點(diǎn)。

1.2.5 仙臺(tái)病毒Tianjin株HN基因、F基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[13]（1）按試劑盒說明書提取病毒RNA。（2）RT-PCR反應(yīng)合成HN基因和F基因片段及回收：引物設(shè)計(jì)：HN基因上游引物：5′-CCCAAGCTTATGGATGGCGATAAACGT-3′（HindⅢ）,下游引物5′-CGGAATTCTTATGACTCGACCTTGCA-3′（EcoRI），F(xiàn)基因上游引物：5′-CCCAAGCTTATGGCGACCTATACTTTAAG-3′（HindⅢ）,下游引物5′-CGGAATTCTCATCTTTTCTCAGTCAT-3′（EcoRI）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃1min，56℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果,回收目的片段。（3）質(zhì)粒構(gòu)建：將目的片段及真核表達(dá)載體pVAX1經(jīng)HindⅢ和EcoRI內(nèi)切酶作用后回收連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，小量提取質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定并測(cè)序，目的片段與預(yù)期相符，證明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。（4）大量提取質(zhì)粒，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒OD值,調(diào)整質(zhì)粒濃度為1mg/ml。1.2.6真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-F、pVAX1-HN抗體的制備及中和作用 將濃度為1mg/ml的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，分pVAX1-F組、pVAX1-HN組、pVAX1-F+pVAX1-HN組、空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組，每組5只，50μg/只，右后肢肌肉注射，共免疫4次，每次間隔1周；取免疫血清倍比稀釋后與100TCID50/0.1ml的hPIV-1進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，計(jì)算50%血清中和終點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 SeV多克隆抗體中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5份SeV免疫血清的血清抗體效價(jià)在1:3200～1:5000之間；50%中和終點(diǎn)分別為39.8、12.6、16.0、44.7、25.1，表1為 SeV多抗和hPIV-1的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 SeV多克隆抗體對(duì)hPIV-1的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按R-M公式計(jì)算，1∶12.6的血清稀釋度能保護(hù)50%的細(xì)胞不產(chǎn)生病變，病變效果見圖1。

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果 經(jīng)HindⅢ/EcoRI雙酶切鑒定，目的片段大小與預(yù)期一致（約1700bp）（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的質(zhì)粒與參考序列一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 各分組質(zhì)?？贵w中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 數(shù)據(jù)結(jié)果顯示pVAX1-HN質(zhì)粒和pVAX1-F質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合免疫血清抗體的中和作用和空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明 pVAX1-HN質(zhì)粒和pVAX1-F質(zhì)粒對(duì) hPIV-1有中和作用，并按pVAX1-HN+pVAX1-F組>pVAX1-HN組>pVAX1-F組依次遞減?？召|(zhì)粒組對(duì)hPIV-1沒有產(chǎn)生中和作用（表2）。

表2 質(zhì)粒免疫血清抗體中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表2 質(zhì)粒免疫血清抗體中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

n=5,*P＜0.01

組別pVAX1-HN pVAX1-F pVAX1-HN+pVAX1-F pVAX1Control 50%血清中和終點(diǎn)12.35±4.09* 3.19±1.83* 21.17±3.06* 00

3 討論

因?yàn)闄C(jī)體對(duì)hPIV產(chǎn)生免疫保護(hù)的持續(xù)時(shí)間短，再感染常見，而嬰幼兒抗體應(yīng)答能力相對(duì)較弱，因此容易反復(fù)發(fā)生感染。目前hPIV滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗和亞單位疫苗均已研究成功，牛PIV3疫苗已證實(shí)對(duì)嬰兒安全有效。上述疫苗由于接種后免疫力不完全，所以在人體尚未廣泛應(yīng)用[4]。

hPIV對(duì)成人所致感染較少，這也可能跟成人免疫力較完全及有過感染SeV的經(jīng)歷而在體內(nèi)形成一定抗體有關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，仙臺(tái)病毒Tianjin株免疫機(jī)體制備的血清抗體對(duì)hPIV-1有一定的中和作用，顯示它們的抗原性相關(guān)，為仙臺(tái)病毒Tianjin株也有可能成為制備hPIV-1疫苗的有效毒株提供了理論基礎(chǔ)。

仙臺(tái)病毒感染宿主細(xì)胞的第一步由兩種包膜糖蛋白HN蛋白和F蛋白介導(dǎo)，其中HN蛋白具有受體識(shí)別活性、神經(jīng)氨酸酶活性及促細(xì)胞融合作用3種主要的生物學(xué)功能，F(xiàn)蛋白具有細(xì)胞融合和溶血活性，兩種糖蛋白在病毒吸附細(xì)胞表面和侵入靶細(xì)胞的過程中起決定作用[14-15]。質(zhì)粒分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HN蛋白在阻止病毒入侵宿主細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)中起主要作用，F(xiàn)蛋白對(duì)其具有輔助作用，因此兩種質(zhì)粒聯(lián)合免疫血清抗體對(duì)hPIV-1的中和效果最好。核酸疫苗由于具有免疫保護(hù)力增強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單、同種異株交叉保護(hù)、應(yīng)用較安全、產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答、穩(wěn)定性好等多種優(yōu)點(diǎn)[16]，是疫苗研究的一個(gè)熱點(diǎn)和重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也為仙臺(tái)病毒制備hPIV-1核酸疫苗的可行性提供了理論依據(jù)。

美國(guó)St.Jude兒童研究醫(yī)院用仙臺(tái)病毒減毒活疫苗在成人的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SeV可誘導(dǎo)成人產(chǎn)生抗hPIV-1抗體[17]。由于受到天然宿主范圍的限制，仙臺(tái)病毒可作為hPIV-1較為安全的候選異源性疫苗[18]。而由于狨猴與人類的親緣性很近，所以在人體免疫應(yīng)答方面仙臺(tái)病毒Tianjin株相較其他仙臺(tái)病毒株可能更具優(yōu)勢(shì)。這對(duì)hPIV-1異源性疫苗的開發(fā)研制拓寬了思路和方向。

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