陳 猛，熊蔚俐，孫 蓓，梁東春，郭 剛，張鏡宇

（天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，天津市激素與發(fā)育重點實驗室，天津 300070）

促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）是垂體前葉嗜堿細(xì)胞合成、分泌的糖蛋白激素，由α鏈和β鏈兩個亞基組成。若以大鼠為實驗動物來研究甲狀腺疾病，TSH的測定是必不可少的。特別是選用大鼠制作甲狀腺功能亢進和甲狀腺功能減退的動物模型時，必須通過檢測血清中甲狀腺激素和TSH的含量來證實動物模型的建立是否成功[1-3]。檢測大鼠血清中TSH不能采用臨床上用于人TSH定量檢測的試劑盒，此類試劑盒采用的是針對人TSH的抗體，若用于檢測大鼠TSH則很可能造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。但是，國內(nèi)市場一直缺少專門針對大鼠TSH的抗體或測定試劑盒。本實驗通過構(gòu)建大鼠TSHα鏈的原核表達系統(tǒng)及表達產(chǎn)物的提純工作，成功獲得重組GST-rrTSHα蛋白。鑒于此前本室已成功克隆并表達了rrTSHβ[4]，至此已具備了開發(fā)大鼠TSH定量檢測試劑盒的必備基礎(chǔ)。另一方面，也為體外合成完整的大鼠TSH分子創(chuàng)造了條件，而大鼠TSH是在用大鼠作為實驗動物建立甲亢動物模型時所必要的。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌菌株 E.coli JM109、E.coli DH5α，質(zhì)粒pGEX-3X為本室保存；pGEM-T Easy載體購自Promega公司。限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶、核酸分子量標(biāo)志物DL2000，中分子量蛋白標(biāo)志物購自TAKARA公司。兔抗GST抗體及Purification Module純化試劑盒為美國Pharmacia公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠TSHα cDNA的克隆 提取正常Wistar大鼠垂體組織總RNA,RT-PCR擴增大鼠TSHα的cDNA序列。引物采用Generunner軟件設(shè)計，序列如下：上游5′GGGGATCCCTTCTCACACCAG3′，下游5′GGGAATTCCTCAGGGTCCCACT3′；擴增產(chǎn)物大小為363bp。5′端3′端分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I及EcoR I識別位點。將目的DNA T-A克隆入pGEMT Easy載體進行DNA序列分析,由北京三博遠志公司完成。

1.2.2 pGEX-3X/TSHα重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組好的pGEM-T Easy/TSHα載體和pGEX-3X載體分別用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切處理，瓊脂糖凝膠電泳回收所需目的條帶。利用T4DNA連接酶構(gòu)建融合表達載體pGEX-3X/TSHα，并將其轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliJM109，挑單一菌落用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切篩選出重組質(zhì)粒進行DNA序列分析，予以確證。DNA測序由北京三博遠志公司完成。

1.2.3 重組大鼠TSHα在E.coliDH5α中的表達 將重組質(zhì)粒pGEX-3X/TSHα轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliDH5α,接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，270r/min震蕩培養(yǎng)16h，次日按1∶100比例接種于3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)液中，振搖至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，270r/min誘導(dǎo)6h。設(shè)立無IPTG誘導(dǎo)的對照，同時以pGEX-3X空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/未轉(zhuǎn)化的菌株作為對照。離心收集菌體經(jīng)PBS清洗后，冰浴下超聲碎菌，離心分別收集上清和沉淀行SDS-PAGE鑒定。

1.2.4 目的蛋白的大量表達和表達條件純化 通過改變誘導(dǎo)劑的濃度，誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)溫度來選擇最佳誘導(dǎo)條件。在最佳條件下大量誘導(dǎo)表達目的蛋白，冰浴下超聲破碎菌體，離心收集包涵體。包涵體經(jīng)濃度梯度升高的尿素溶液洗滌后溶于8mol/L的尿素溶液中，對濃度梯度降低的尿素溶液透析復(fù)性。利用GST Purification Module試劑盒親和層析純化融合蛋白，按操作說明書完成。

1.2.5 Western Blot鑒定融合蛋白 純化后的融合蛋白行SDS-PAGE后將凝膠中的蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用適量的封閉液（5%脫脂奶粉溶于含0.3%Tween20的PBS中），室溫震蕩1～2h后4℃放置過夜。以wash buffer(含0.3%Tween20的PBS)清洗NC膜3次后將其置入一軟塑袋中，充分浸泡于1:500倍稀釋的兔抗GST抗體PBS溶液中，室溫震搖1h。以wash buffer清洗NC膜3次，浸于1:1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體PBS溶液中，室溫震搖1h。取出NC膜，以wash buffer清洗3次，DAB顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增TSHα cDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期的363bp位置上出現(xiàn)特異的DNA條帶，見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 如圖2,用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒pGEX-3X/TSHα，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期的363bp位置上出現(xiàn)DNA條帶，大于2000bp的條帶是酶切后的載體骨架。

2.3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 所表達的融合蛋白N端帶有約26kD大小的GST標(biāo)簽。推算GST-rrTSHα的分子量為38kD左右。由圖3表達產(chǎn)物的SDS-PAGE可見，重組質(zhì)粒pGEX-3X/rTSHα轉(zhuǎn)化DH5α后經(jīng)誘導(dǎo)表達,于碎菌后的沉淀中出現(xiàn)與預(yù)期大小相符38kD的蛋白條帶。

2.4 誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)時間的選擇 以E.coli DH5α為宿主細(xì)胞，37℃，IPTG終濃度為 1mmol/L，誘導(dǎo)表達rrTSHα。誘導(dǎo)后4h即有融合蛋白表達可被PAGE檢測到。隨誘導(dǎo)時間延長，表達量逐漸提高，誘導(dǎo)12h達到高峰，此后隨時間延長而降低。

2.4.2 誘導(dǎo)劑濃度的選擇 以E.coli DH5α為宿主菌，37℃誘導(dǎo)表達rrTSHα，誘導(dǎo)時間均為12h。0.5mmol/L IPTG濃度時包涵體中融合蛋白含量達到高峰。

2.4.3 誘導(dǎo)溫度的選擇 以E.coli DH5α為宿主菌，IPTG終濃度取0.5mmol/L，于20～37.5℃，2.5℃間隔誘導(dǎo)表達rrTSHα。25℃誘導(dǎo)表達12h后，包涵體中融合蛋白表達量達到高峰。

2.5 親和層析純化GST-rrTSHα SDS-PAGE電泳在預(yù)期的38kD左右位置上出現(xiàn)GST-rrTSHα特異帶，見圖4。

2.6 Western Blotting鑒定純化后融合蛋白 經(jīng)Western Blotting鑒定，重組質(zhì)粒pGEX-3X/TSHα轉(zhuǎn)化菌的表達產(chǎn)物在38kD處確有一特異性的條帶,見圖5。

3 討論

由于國內(nèi)一直缺少專門針對大鼠TSH的抗體，本研究所構(gòu)建成功的缺碘致甲低大鼠模型一直缺少血清TSH這一反映甲狀腺功能的重要指標(biāo)。本實驗得到了重組大鼠TSHα鏈，和另一小組獲得的重組大鼠TSHβ鏈可以作為免疫原免疫動物得到相應(yīng)的抗體，用來特異性地檢測大鼠體內(nèi)的TSH水平，進一步證實甲亢或者甲低的動物模型建立的成功與否，具有廣泛的實用意義。由結(jié)果可見，克隆入pGEX-3X質(zhì)粒的大鼠TSHα編碼序列，可以在大腸桿菌中獲得有效的表達，表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在于碎菌后的沉淀中，經(jīng)包涵體的復(fù)性、溶解及隨后的親和層析純化可得到高純度的重組蛋白。該蛋白在電泳中的行為與GST-rrTSHα的分子量相符，且可與抗GST抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。

通過基因工程方法表達重組融合蛋白作為免疫原是制備免疫原的另一種方法[5]，且以包涵體形式表達的蛋白不會影響我們制備高效價的抗體[6]。經(jīng)包涵體洗滌后蛋白已達到較高純度，在此基礎(chǔ)上通過親和層析可方便地從細(xì)菌裂解物中純化蛋白，本研究中原核表達的融合蛋白產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后純度達到了92%，有利于制備高純度的抗體。雖然以此重組蛋白做為免疫原制備的多克隆抗體會含有抗GST的組分，但GST標(biāo)簽的種屬來源是日本血吸蟲，針對此GST的抗體不會與哺乳動物體內(nèi)的GST發(fā)生交叉反應(yīng)。此外還可采用GST親和層析柱以除去抗GST抗體組分[7]。綜上所述，我們已完成了大鼠TSHα及β亞基的全部表達工作，下一步將制備兩者針對性抗體用于大鼠TSH的測定。

［1］ Paschke R,Ludgate M.The thyrotropin receptor in thyroid disease [J].N Engl J Med,1997,337(23):1675

［2］ Davies T,Marians R,Latif R.The TSH receptor reveal itself[J].J Clin Invest,2002,110(2):161

［3］ Vassart G,Dumont JE.The thyrotropin receptor and the regulation of thyrocyte function and growth[J].Endocr Rev,1992,13(3):596

［4］ 馬香書，馬彥，孫蓓，等.大腸桿菌偏嗜性人促甲狀腺激素β亞基編碼DNA序列的克隆及表達[J].天津醫(yī)藥，2009，37(5):340

［5］ Yau KY,Lee H,Hall JC.Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies[J].Biotechnol Adv,2003,21(7):599

［6］ Kim YI,Ha YM,Nam YK,et al.Production of polyclonal antibody against recombinant ORF 112L of rock bream(Oplegnathus fasciatus)iridovirus (RBIV)and in vitro neutralization[J].J Environ Biol,2008,29(4):571

［7］ Wu C,Wang Y,Zou M,et al.Prokaryotic expression,purification, and production of polyclonal antibody against human polypeptide N-acetylgalacto-saminyltransferase 14[J].Protein Expr Purif, 2007,56(1):1