龔志華，黃甜，龐月蘭，肖文軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學 a.園藝園林學院；b.茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128）

茶多酚對茶葉品質的影響最顯著[1]．自20世紀90年代后，隨著“綠色化學”口號的提出，越來越多的學者致力于對茶多酚生產(chǎn)過程的精細化，其研究多集中于茶多酚的主體部分兒茶素（占茶多酚總量的70%～80%），尤其是兒茶素中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCg）．

EGCg是茶葉中的主要兒茶素之一，占茶多酚總量的40%～50%，作為天然抗氧化劑和自由基清除劑，具有明顯的抗衰老、抗突變、防癌抗癌、預防心血管疾病、防輻射等多種生物學活性，廣泛運用于食品加工、醫(yī)藥保健和日用化工領域[2-5]．是酯型兒茶素單體EGCg的分離純化，成為兒茶素分離、純化與臨床應用研究的焦點．

分離兒茶素單體的過程[6]主要為：提取茶多酚粗品（TP）→分離兒茶素→純化兒茶素單體．目前分離制備兒茶素單體的方法主要有柱色譜法[7]、柱色譜預分離-制備型 HPLC純化法[8]、有機溶劑富集-柱色譜純化、高效液相色譜法[9]、高速逆流色譜法（HSCCC）[10]、沉淀-吸附法[11]、有機溶劑萃取法[12]等，但在降低成本、提高得率、保持產(chǎn)物的天然活性以及實現(xiàn)工業(yè)化等方面依然存在技術瓶頸．

筆者以EGCg含量為35.52%的兒茶素粗提物為原料，應用近年出現(xiàn)的新型大孔吸附樹脂HP-20對EGCg進行分離純化試驗，并對相關技術參數(shù)進行了優(yōu)化篩選，以期為工業(yè)化生產(chǎn)制備高純EGCg提供新途徑．

1 材料與方法

1.1 材 料

70%小葉兒茶素（EGCg含量為31.52%，湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司產(chǎn)品）；HP-20、D202、XDA-1、D201、D900、LSA-7大孔吸附樹脂（長沙市化學試劑玻璃儀器有限公司產(chǎn)品）．

1.2 方 法

（1） 樹脂預處理．大孔吸附樹脂上柱前，分別清洗干凈，即采用95%乙醇浸泡充分溶脹→95 %乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象→去離子水洗盡乙醇后，以4倍體積3%NaOH溶液浸泡4 h→去離子水洗至pH值為中性→4倍體積3%HCl溶液浸泡4 h→去離子水洗至pH值中性．

（2） 原料液制備．按照每次試驗的上樣量將兒茶素粗提物溶于蒸餾水，配制成質量分數(shù)為20%的水溶液．

（3） 不同大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸效果比較．將經(jīng)預處理的6種大孔吸附樹脂去表面水，各精密稱取1 g，置于具塞磨口錐形瓶中，分別加入50 mL的原料液，搖床振蕩24 h，過濾，檢測濾液中EGCg的含量，計算單位質量樹脂對EGCg的吸附量，并將吸附飽和的樹脂再各用50 mL 95%乙醇解吸24 h，檢測解吸液中EGCg的含量，計算其解吸率，篩選對EGCg吸附與解吸具有最佳效果的樹脂．

（4） 最佳吸附與解吸效果樹脂的等梯度洗脫條件優(yōu)化．以乙醇為洗脫劑，設計乙醇體積分數(shù)（20%、40%、60%等3個水平）、洗脫流速（0.5、1.0、2.0 BV/h等3個水平）、上樣量（0.2、0.6、1.8 g等3個水平）、洗脫體積（2、4、6等3個水平）的正交試驗[13-15]，優(yōu)化篩選最佳樹脂的等梯度洗脫參數(shù)．

（5） 最佳吸附與解吸效果樹脂的連續(xù)梯度洗脫條件優(yōu)化．以EGCg得率與純度為考察指標，以上述試驗中最佳等梯度洗脫技術參數(shù)為基礎，保持流速、上樣量、洗脫體積不變，分別以30%、35%、40%、45%、50%乙醇進行連續(xù)梯度洗脫，分段收集洗脫液至流出液無色時，換下一梯度進行洗脫，篩選連續(xù)梯度洗脫的最佳乙醇體積分數(shù)．以最佳乙醇體積分數(shù)、洗脫流速、上樣量、洗脫體積為操作參數(shù)，將原料液重新上柱進行洗脫，每收集0.5 BV洗脫液作為一個樣品，篩選EGCg得率、純度綜合效果較好的收集段．

EGCg含量采用高效液相色譜法測定．色譜柱：Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：278 nm；進樣量：10 μL；流動相：采用二元梯度洗脫，A相為超純水，B相為有機相（N,N-二甲基甲酰胺∶甲醇∶冰醋酸 = 80∶4∶3）；梯度條件：B相，0.01 min時17%、15 min時20%、28 min時32%、34 min時32%、36 min時17%、40 min時17%．

水浸出物含量測定采用全量法[16]．

EGCg純度、EGCg得率計算參照文獻[15]方法．

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用正交設計助手IIV3.1.1軟件進行．

2 結果與分析

2.1 不同大孔吸附樹脂對 EGCg的靜態(tài)吸附與解吸效果

HP-20、D202、XDA-1、D201、D900、LSA-7等6種大孔吸附樹脂對EGCg的吸附量和洗脫率如表1所示．由表1可知，單位質量的HP-20大孔吸附樹脂對EGCg具有較好的吸附與解吸效果，其靜態(tài)解吸量達46.47 mg/g，在6種樹脂中效果最佳．

表1 不同樹脂對EGCg的靜態(tài)吸附量與靜態(tài)洗脫率Table 1 The static adsorption capacity and the static desorption percentage of EGCg by different resins

2.2 HP-20樹脂的等梯度洗脫條件優(yōu)化

HP-20對EGCg的等梯度洗脫正交試驗結果如表2所示．結果表明，以EGCg的得率和純度作為考察指標，對EGCg洗脫得率影響的顯著程度大小依次為乙醇體積分數(shù)、上樣量、洗脫流速、洗脫體積，并以1.8 g上樣量、2 BV/h流速、40%乙醇、洗脫體積2 BV為最佳組合，在此工藝條件下，EGCg的得率與純度分別為95.22 %和55.92 %．

表2 正交試驗中EGCg得率與純度的極差分析Table 2 The poor analysis of EGCg yield rate and purity in orthogonal experiment

2.3 HP-20樹脂的連續(xù)梯度洗脫條件優(yōu)化

2.3.1 乙醇體積分數(shù)的篩選

結果（表3）表明，采用30%乙醇洗脫并收集1～5號樣，幾乎可以把EGCg完全洗脫下來，其中3號樣的純度和得率最高，可達68.28%和45.71%．同時，EGCg主要集中在0.6～2.5 BV段（圖1），其后的洗脫液中 EGCg純度及得率均較低，因此收集30%乙醇洗脫液中的0.6～2.5 BV體積段，可得到較高純度及含量的EGCg．

表3 不同體積分數(shù)乙醇洗脫EGCg得率和純度Table 3 Effect of different ethanol concentration on the yield rate and purity of EGCg

圖1 30%乙醇梯度洗脫EGCg純度及得率Fig.1 The curve of EGCg’s yield rate and purity in gradient elution by 30% ethanol

2.3.2 EGCg得率、純度綜合效果較好收集段篩選

表4結果表明，在30%乙醇，125 mL樹脂上樣1.8 g，2 BV/h流速的條件下，收集的第3個樣液,，EGCg純度最高，可達71.55%，得率為28.14%．第2個收集樣液的EGCg純度與得率分別為65.09 %和43.94%，因此合并兩個收集段的樣液，EGCg的純度與得率分別為68.32%和72.08%．將所得合并液濃縮、結晶，可得到相應的EGCg高純品，符合工業(yè)化高效生產(chǎn)高純EGCg的技術要求．

表4 30%乙醇洗脫分步收集EGCg的得率與純度Table 4 The extraction yield and purity of EGCg collected step by step by 30% ethanol

3 結 論

HP-20大孔樹脂具有較好的分離純化 EGCg的性能，其最優(yōu)工藝技術參數(shù)為：柱體積為125 mL分離純化EGCg時，上樣量1.8 g、30%乙醇、流速2 BV/h、洗脫體積2 BV，收集1～2 BV體積段的洗脫液，EGCg的純度和得率分別達 68.32%和72.08%，具有較好的工業(yè)化應用價值．

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英文編輯：胡東平