章卓，雷紅宇，蘇建明*

（1.全國畜牧總站，北京 100125；2.湖南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

魚類是最早兼有特異性免疫與非特異性免疫的脊椎動物，由于其特異性免疫還不完善，抗體生成又受到水溫等多種環(huán)境因素的影響，因此非特異性免疫以其反應快速、具有抗病作用而成為魚類抵抗病原入侵的第一道防線[1]．哺乳動物黏膜免疫研究日前已備受重視[2]，而對魚類的免疫學研究目前大多集中在系統(tǒng)免疫上，對黏膜免疫的研究還不夠深入[3]．腸道存在多種常駐菌群．腸道在與這些微生物共存的同時，也可對存在的有害微生物或被腸道吸附的異己物質進行有效的識別，并加以排除．在感染情況下，腸上皮細胞可表達共刺激分子I-CAM-1，并通過MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子將抗原提呈給CD類型T細胞，引起免疫反應[4]．在魚類腸道沒有類似哺乳動物的Peyer氏淋巴結，可能影響對抗原的攝取與提呈[1]．目前，以腸道組織為材料，探討其在外界抗原誘導下表達基因的研究較少．筆者采用抑制性消減雜交技術，構建了草魚腸道組織抑制性消減cDNA文庫，獲得了一定數(shù)量的草魚腸道組織差異表達的EST序列，并對獲得的序列進行了生物信息學分析，現(xiàn)將結果報道如下．

1 材料與方法

1.1 材 料

供試草魚4條，體長（20.4±1.8） cm．2條經(jīng)嗜水氣單胞菌灌服誘導，2 d后取腸道組織，用DEPC水處理的無菌水清洗3次，用于感染組消減文庫構建；另2條不進行感染處理，同樣取出腸道組織用作對照．

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取

按照總RNA提取試劑盒Trizol（Invitrogen）說明書操作，分別從感染組和對照組的腸道組織中提取總RNA；提取的總RNA用PolyATract mRNA Isolation System（Promega）試劑盒進行mRNA分離純化．

1.2.2 消減cDNA文庫的構建

以感染組腸道組織作為檢測子樣品，以對照組腸道組織作為驅動子樣品，參考PCR-select cDNA Subtraction Kit（Clontech）的操作手冊進行差減雜交[5]．

1.2.3 文庫的篩選以及序列分析

圖 1 插入cDNA片段的PCR產物電泳結果Fig.1 PCR products electrophoresis of the inserted cDNA fragments

隨機挑取24個克隆，利用載體引物M13+ （5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTG-3′）和M13－（5′-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3′）進行PCR擴增，確定cDNA插入片段的長度；采用同樣的方法篩選cDNA克隆，片段長度大于300 bp的用于測序．隨機挑取PCR篩選后的克隆，37 ℃液體培養(yǎng)過夜后，提取質粒（Qiagene）．利用載體引物M13+/－為測序引物進行測序，測序由上海英駿生物技術有限公司完成．采用DNAMAN序列分析軟件對測序結果原始序列進行分析，去掉兩端的載體序列以及難以辨認的核苷酸，個別堿基通過軟件Chromas與原始序列文件比對進行更正．

測序結果用Blast在GenBank中進行同源性搜索比對分析，E值小于－6時認為具有較好的同源性[6]．搜索順序依次為 BlastX （the nonredundant protein library，非重復蛋白質文庫）、BlastN（the nonredundant nucleotide library，非重復核酸文庫）[7]，并根據(jù)其對應的同源物對其進行注釋和歸類分析．

2 結果與分析

2.1 PCR檢測消減文庫質量

對隨機挑取的克隆進行PCR檢測，結果（圖1）顯示克隆片段為0.25～1.50 kb．隨機挑選的24個克隆插入片段平均長度為0.75 kb，最短的為0.25 kb，最長的為1.5 kb，與文庫構建經(jīng)第2次PCR檢測的預期結果相一致，構建的消減cDNA文庫質量較好．

2.2 消減cDNA EST序列的統(tǒng)計與分析

對211個克隆中的cDNA進行單向測序, 除去測序效果不好、堿基無法辨認或序列測序片段小于150 bp的序列，實際共獲得147個序列EST（非rRNA和chondriogene序列測序的錯誤率小于5%）．相似性搜索結果表明，有97個克隆和GenBank中的已知功能的序列具有較高的同源性（分值＞100）；17個與未知功能的開放閱讀框具有較高的相似性，稱之為假定蛋白；33個序列在同源性搜索中沒有找到任何對應的相似序列，它們很可能是目前還沒有鑒定的EST或是5′-或3′-UTR序列．

2.3 消減cDNA EST功能分類

根據(jù) Ademas等[8]對人類功能基因的分類方法，將獲得的EST 序列按BLAST得到的相似性序列功能進行分類，結果見表1、表2．97個已知功能的 EST分別屬于46個不同的基因．在獲得的已知功能EST序列中，與細胞防御和基因表達有關的蛋白分別占EST簇數(shù)的28.26%、19.57%；與代謝和信號傳導有關的蛋白分別占EST簇數(shù)的23.91%、19.57%．和細胞結構與運動、細胞分裂有關的基因分別只有3、1個，EST簇數(shù)也分別只有3、1個．

表 1 與GenBank中編碼已知功能蛋白質和假定蛋白質序列有同源性的草魚ESTTable 1 Grass carp ESTs matched to sequences encoding for known function protein and putative protein in GenBank datbase

續(xù)表

表2 編碼已知蛋白表達序列標簽（EST）的功能分類Table 2 functional categories of ESTs encoding known proteins

3 討 論

目前，已針對牙鲆[9-12]、鯰魚[13]、虹鱒[14]、鯉魚[15]、草魚[16]和扇貝[17]等，采用抑制消減雜交技術開展了相關基因的克隆與表達，獲得了許多發(fā)育、代謝及免疫的相關基因．筆者采用抑制消減雜交技術構建了人工感染致病性細菌后草魚腸道組織差異表達的cDNA文庫．在獲得的EST序列中，與細胞防御相關基因的EST最多，表明在細菌誘導下，機體產生了免疫反應過程，經(jīng)Blast分析獲得多個免疫抗病相關基因，如MHC、transferrin、CD9、AMBP、Crystallin等[18-19]．MHC參與免疫反應過程對抗原的識別沒有特異性，屬于機體免疫系統(tǒng)的非特異性免疫體系．相對高等脊椎動物，作為低等脊椎動物的魚類，其特異性防御機制并不完善，魚類的非特異性免疫系統(tǒng)在其自身抗病作用中較特異性免疫系統(tǒng)可能發(fā)揮了更大的作用．除了MHC之外，轉鐵蛋白獲得4個克隆[20]．鐵蛋白對由應激、化學物質（尿素、鹽酸胍）引起的變性有很強的抵抗力[21]．新基因α-1微球蛋白/bikunin前體主要在肝臟中表達，后分離成α-1微球蛋白和胰蛋白酶抑制劑-bikunin．α-1微球蛋白在動物體內分布較廣，在人體內參與了免疫調節(jié)作用[22]，但其確切的生理功能和發(fā)生機制還不清楚．試驗中還發(fā)現(xiàn) 1個Z-Crystallin基因，屬于 Crystallin家族蛋白．對Crystallin蛋白的研究[23]表明，α、β-Crystallin蛋白為小分子伴侶蛋白，在老化進程、應激反應中發(fā)揮重要作用．Z-Crystallin是種NADPH氧化還原酶，與乙醇脫氫酶序列類似，但無乙醇脫氫酶活性，廣泛參與機體的應激反應，說明草魚在細菌的誘導下，機體在啟動自身免疫反應的同時，也加強了自身代謝與基因表達的適應性反應[24]．

本研究中，通過抑制性消減雜交技術獲得了一定數(shù)量的差異表達基因．由于測定的cDNA數(shù)目有限，遠遠低于細胞表達的基因數(shù)，但也初步反映了草魚腸道組織在病原菌的誘導下機體對外來刺激反應的基因表達分布，獲得了不少新基因，特別是與免疫作用有關的基因的鑒定．研究這些基因的功能將為魚類黏膜分子免疫機制研究打下重要的信息基礎．

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英文編輯：羅文翠