劉保光，劉建華，吳華，陳玉霞，胡功政，徐利納，陳燕杰，孟春萍

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

產(chǎn)生超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases, ESBLs）是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥最重要的機(jī)制[1]．ESBLs主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是其代表菌種，其他如沙門菌、枸櫞酸桿菌等也可產(chǎn)生[2]．ESBLs的特點(diǎn)是其能水解氧氨基頭孢菌素和氨曲南，但能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[3]．ESBLs產(chǎn)生菌，不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素耐藥，而且也對(duì)氟喹諾酮類、氨基糖苷類、氟苯尼考、多西環(huán)素耐藥[4]，即呈多重耐藥特點(diǎn)．將β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉聯(lián)用，可大大提高其對(duì)產(chǎn) ESBLs抗菌的活性[5]．舒巴坦鈉與β-內(nèi)酰胺環(huán)類聯(lián)用的抗菌作用國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道[5-7]，膜通透性促進(jìn)劑 EDTA能增加抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的抗菌作用國(guó)外已有報(bào)道[8]，在國(guó)內(nèi)僅有 1篇[9]．關(guān)于舒巴坦鈉、EDTA對(duì)產(chǎn)ESBLs菌的抗菌作用，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室已有的研究結(jié)果表明，在動(dòng)物方面，產(chǎn)ESBLs與膜通透性降低在細(xì)菌多重耐藥產(chǎn)生中有協(xié)同作用，但首次研究試驗(yàn)菌株較少，僅有6株．為了使結(jié)果更具代表性，筆者選擇 18株新近分離的產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌，分別研究酶抑制劑舒巴坦鈉、膜通透性促進(jìn)劑EDTA及二者聯(lián)用對(duì)抗菌藥物敏感性的影響，為產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌感染的控制提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

18株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離，是從24株雞大腸桿菌分離菌中按CLSI方法[10]通過(guò)表型篩選和確證實(shí)驗(yàn)證實(shí)后選出的，經(jīng)過(guò)法國(guó)生物梅里埃Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定．質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由中國(guó)普通微生物菌種保存中心提供．

1.1.2 培養(yǎng)基

主要培養(yǎng)基成分為 MH肉湯、麥康凱瓊脂、MH（A）培養(yǎng)基和GN增菌液．

1.1.3 藥敏紙片及藥品

氨曲南 （AZT，每片30 μg）、頭孢曲松 （CRO，每片30 μg）、頭孢泊肟 （CPO，每片30 μg）、頭孢噻肟 （CTX，每片30 μg）、頭孢噻肟/棒酸 （CTC，每片30/10μg）、頭孢他啶 （CAZ，每片30 μg）、頭孢他啶/棒酸 （CAC，每片30/10μg）均由北京天壇藥物公司提供．加替沙星（GAT）、乳酸環(huán)丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、磷霉素（FOS）、舒巴坦鈉（SBT）、頭孢噻呋（CTF）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢吡肟（CPM）、多西環(huán)素（DOX）、阿米卡星（AK）和氟苯尼考（FLO）均由河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供．

1.1.4 試驗(yàn)儀器

主要試驗(yàn)儀器為Vitek-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、磁力攪拌器、手提式電熱壓力蒸汽消毒器、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平、振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、真空干燥箱、微量移液器．

1.2 方 法

采用微量肉湯稀釋法，先測(cè)定左氧氟沙星、加替沙星等10種抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC），再分別測(cè)定這些藥物與舒巴坦鈉、EDTA以及舒巴坦鈉+EDTA聯(lián)用的MIC．藥物與舒巴坦鈉的質(zhì)量比為 2∶1，EDTA濃度為1/2MIC．標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)控菌．耐藥臨界值按CLSI頒布的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)[10-11]判定．

2 結(jié)果與分析

10種抗菌藥物及其與舒巴坦鈉、EDTA、舒巴坦鈉+EDTA聯(lián)用對(duì)18株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性見表1、表2．

表1 10種抗菌藥及其與舒巴坦鈉聯(lián)用對(duì)18株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of 10 antimicrobial drugs alone and in combination with sulbactam on 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

續(xù)表

從表1可以看出，18株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率均達(dá)到 100%，加入舒巴坦鈉后耐藥率沒有變化；對(duì)第三代頭孢菌素類（頭孢噻呋、頭孢噻肟）的耐藥率也較高，但加入舒巴坦鈉后，對(duì)頭孢噻肟的耐藥率變?yōu)?0；對(duì)氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素的耐藥率達(dá)到100%，加入舒巴坦鈉后都有所降低，對(duì)磷霉素的耐藥率變?yōu)?；對(duì)多西環(huán)素的耐藥率在加入舒巴坦鈉前后沒有明顯變化．

表2 10種抗菌藥分別與EDTA、EDTA+舒巴坦鈉聯(lián)用對(duì)18株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of 10 antimicrobial combinations with EDTA and sulbactam+EDTA against 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

從表2可以看出，18株產(chǎn)ESBLs的雞大腸桿菌對(duì)加入EDTA加替沙星的耐藥率降至30%，但對(duì)加替沙星+EDTA+舒巴坦鈉、環(huán)丙沙星+EDTA+舒巴坦鈉的耐藥率，與對(duì)加替沙星+EDTA、環(huán)丙沙星+EDTA的耐藥率無(wú)差異．

綜合分析表1、表2可知，對(duì)加入EDTA的頭孢噻呋的耐藥率與對(duì)頭孢噻呋單用的耐藥率沒有變化，但對(duì)第三代頭孢菌素類+EDTA+舒巴坦鈉的耐藥率比對(duì)第三代頭孢菌素類僅與EDTA或舒巴坦鈉聯(lián)用的耐藥率有所降低；對(duì)加入EDTA的多西環(huán)素、氟苯尼考、阿米卡星的耐藥率均比對(duì)單藥的耐藥率低，對(duì)氟苯尼考、阿米卡星、多西環(huán)素分別與EDTA+舒巴坦鈉聯(lián)用的耐藥率均比僅與EDTA或舒巴坦鈉聯(lián)用的耐藥率低．

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)檢測(cè)的產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌均呈多重耐藥特性，一是因?yàn)殡u大腸桿菌攜帶ESBLs的質(zhì)粒同時(shí)攜帶有氟喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗菌藥的耐藥基因，使產(chǎn)ESBLs菌具有多重耐藥表型[4]，二是因?yàn)楫a(chǎn)生ESBLs等特異性耐藥機(jī)制和外膜通透性降低、主動(dòng)外排作用等非特異性耐藥機(jī)制協(xié)同存在導(dǎo)致了多重耐藥．舒巴坦鈉與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能明顯提高對(duì)產(chǎn)酶耐藥菌的體外抗菌活性[5]．本試驗(yàn)結(jié)果表明，舒巴坦鈉不僅能增強(qiáng)第三代頭孢菌素類抗生素對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性，而且能明顯提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性．其原因可能是舒巴坦鈉本身對(duì)產(chǎn)ESBLs菌有一定的內(nèi)在活性，或當(dāng)用舒巴坦鈉抑制ESBLs后，膜通透性改變，主動(dòng)外排的作用亦相應(yīng)減弱，從而在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度增加，使這3種藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性相應(yīng)增強(qiáng)，其具體分子機(jī)制有待研究．

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氟喹諾酮類、頭孢噻肟、多西環(huán)素、氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素加入EDTA后對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的MIC降低，部分菌株可恢復(fù)敏感性．大多抗菌藥物，如β-內(nèi)酰胺類、氯霉素、磷霉素、氨基糖苷類藥物，均主要通過(guò)大腸桿菌外膜蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用[12]．文獻(xiàn)[13]報(bào)道，EDTA作為一種常見的膜通透性促進(jìn)劑，可以與維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的必需成分Ca2+、Mg2+等絡(luò)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞流動(dòng)性和通透性增加，最終結(jié)果是增加藥物進(jìn)入細(xì)菌的濃度，以對(duì)抗外膜滲透性降低及藥物外排泵出增強(qiáng)的多重耐藥機(jī)制．文獻(xiàn)[9]報(bào)道，在各抗菌藥物中加入EDTA可治療多重耐藥細(xì)菌感染．在本試驗(yàn)中觀察到，在抗菌藥物中加入 EDTA使產(chǎn)ESBLs的多重耐藥菌對(duì)多數(shù)抗菌藥恢復(fù)了敏感性，說(shuō)明EDTA與抗菌藥聯(lián)用，對(duì)控制多重耐藥菌感染有應(yīng)用價(jià)值．

本試驗(yàn)結(jié)果表明，第三代頭孢菌素、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素與舒巴坦鈉+EDTA聯(lián)用的MIC，均比與舒巴坦鈉、EDTA聯(lián)用的MIC有所下降．這表明，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉與膜通透性促進(jìn)劑EDTA聯(lián)用，不僅對(duì)提高β-內(nèi)酰胺環(huán)類藥物的抗菌活性有協(xié)同作用，而且對(duì)提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性有協(xié)同作用，從而進(jìn)一步從表型上證明了特異性耐藥機(jī)制產(chǎn)生 ESBLs與非特異性耐藥機(jī)制膜通透性降低在產(chǎn) ESBLs禽大腸桿菌多重耐藥中有協(xié)同作用．據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，舒巴坦鈉+EDTA與第三代頭孢、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素等聯(lián)用，可能在產(chǎn)ESBLs多重耐藥禽大腸桿菌的防治上有應(yīng)用前景．

[1] Bradford P A．Extended-spectrum β-Lactamases in the 21st century：Characterization，epidemiology，and detection of this important resistance threat[J]．Cin Microbiol Rev，2001，14：933-951．

[2] 匡秀華，楊玉榮，胡功政，等．雞腸桿菌科細(xì)菌 β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)及藥敏分析[J]．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（2）：170-174．

[3] Bush K, Jacoby G A, Medeiros A A．A functional classification scheme for β-Lactamases and its correlation with molecular structure[J]．Antimicrob Agents Chemother，1995，39：1211-1233．

[4] Paterson D L, Mulazimoglu L, Casellas J M, et al．Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum β-Lactamase production inKlebsiella pneumoniaeisolates causing bacteremia[J]．Clin Infect Dis，2000，30：473-478．

[5] 胡功政，張春輝，梁軍，等． 豬雞致病菌β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)與藥敏分析[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（2）：399-404．

[6] Fuchs P C, Stickel S, Anderson P H, et al．In vitroinactivation of aminoglycosides by sulbactam，other betalactams，and sulbactam-betalactam combinations[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1991，35（1）：182-184．

[7] 張春輝，周青云，胡功政．舒巴坦鈉與常見 β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素的體外抑菌試驗(yàn)[J]．中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005，24（5）：36-37．

[8] Bernard Lakaye，Alain Dubus，Bernard Joris．Method for estimation of low outer membrane permeability to β-Lactam Antibiotics[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，9：2901-2907.

[9] 龐曉軍，莫國(guó)艷，利春紅，等．乙二胺四醋酸使耐藥菌恢復(fù)對(duì)抗菌藥物敏感性的研究[J]．中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（14）：1182-1184．

[10] M100-S18 CLSI document[S]．

[11] M31-A3 CLSI document[S]．

[12] Nikaido H．Prevention of drug access to bacterial targets: Permeability barriers and active efflux[J]．Science，1994，264：382-388．

[13] 嚴(yán)杰，錢利生，余傳霖．臨床醫(yī)學(xué)分子細(xì)菌學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：570-572．

英文編輯：羅文翠