劉敬博,柴同杰,苗增民,劉曉敏

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東泰安271018)

生物氣溶膠是大氣氣溶膠中有活性的部分,主要包括細(xì)菌、真菌和病毒等,它可以借助空氣介質(zhì)擴散和傳輸,引發(fā)人類急、慢性疾病,如傳染病、過敏癥或中毒以及動植物疾病的流行傳播[1]。畜禽舍環(huán)境中產(chǎn)生的微生物氣溶膠不僅對畜禽和養(yǎng)殖人員的健康造成威脅,而且還會對外界環(huán)境造成污染[2]。許多重大畜禽烈性傳染病是通過氣溶膠進行傳播的,其病原微生物能夠借助氣溶膠傳播到很遠(yuǎn)的距離,威脅性大,且較難控制。因此,檢測不同養(yǎng)殖環(huán)境中微生物氣溶膠濃度,并獲知其污染狀況意義重大。

微生物氣溶膠濃度的檢測方法較多,傳統(tǒng)的方法是培養(yǎng)后的菌落計數(shù)(cfu/m3空氣),近年來,隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)方法的進步,常采用DNA染色后的直接鏡檢計數(shù)(如DAPI,吖啶橙)和熒光原位雜交(FISH),以及更直接的定量PCR技術(shù)等[3-6]。目前最常用的是培養(yǎng)后的菌落計數(shù),但該方法不能準(zhǔn)確反映微生物的實際含量。據(jù)報道,僅有0.3%～10%的微生物可被培養(yǎng)計數(shù)[3,7-8]。然而,DAPI染色法已被認(rèn)為是一種標(biāo)準(zhǔn)的測定浮游微生物總量的方法,而且操作簡便,計數(shù)準(zhǔn)確[9-10]。

就養(yǎng)殖環(huán)境而言,目前還缺乏其清潔指標(biāo),準(zhǔn)確監(jiān)測不同環(huán)境微生物氣溶膠的含量,有助于調(diào)整畜禽生產(chǎn)和減少對健康的危害。本研究采用DNA染色后直接鏡檢計數(shù)的方法來測定養(yǎng)殖環(huán)境內(nèi)微生物氣溶膠的濃度,得到較理想的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究于2009年6月～2009年12月在泰安、棗莊兩地分別對2個雞舍、1個豬舍和2個牛舍進行檢測。將國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI-30空氣采樣器置于畜禽舍中央,離地面1.0 m左右。以50 mL的無菌生理鹽水為采樣介質(zhì),采樣時氣流速度為12.5 L/min,驅(qū)動時間為20 min。在采樣的同時,記錄舍內(nèi)溫?zé)嶂笜?biāo)。

1.2 培養(yǎng)法計數(shù)

取25 mL空氣采樣液輕輕搖勻,然后均勻的分成3份,一份以含50 mL/L綿羊血的營養(yǎng)瓊脂為培養(yǎng)基,用于需氧細(xì)菌培養(yǎng);另一份以含體積分?jǐn)?shù)5%綿羊血的營養(yǎng)瓊脂為培養(yǎng)基,用于厭氧細(xì)菌培養(yǎng);第3份以沙保弱為培養(yǎng)基,用于真菌培養(yǎng),以上每個樣品各重復(fù)3次。細(xì)菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～48 h后計數(shù),真菌在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～7 d后計數(shù)。校正后計算微生物氣溶膠(細(xì)菌和真菌)濃度(CFU/m3)。

1.3 DNA染色后計數(shù)

將剩余的25 mL采樣液放入50 mL玻璃瓶中(該瓶先經(jīng)過鉻酸浸泡,后經(jīng)高壓滅菌處理),隨即加入5 mL福爾馬林,再加入7.5 mL DAPI染液(20 μ g/mL),然后置于暗室中染色10 min,最后在小于0.07大氣壓的條件下用硝酸纖維濾膜(經(jīng)蘇丹黑B染液浸泡4 h以上,使其變黑)對采樣液進行抽濾。抽干后將硝酸纖維濾膜取出,置于滴有鏡油的載玻片上進行計數(shù),每一個細(xì)胞代表一個微生物氣溶膠粒子(個/m3)[11]。

表1 不同畜禽舍采樣時的基本情況Table 1 Backg round information on tested corral and herding sites

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11.5軟件和Excel2007對數(shù)據(jù)進行方差分析及差異性比較。

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色后計數(shù)的結(jié)果

利用DAPI染色的方法測得的2個雞舍、1個豬舍和2個牛舍微生物氣溶膠的濃度(中間值)分別為:166×106、166×106、136×106、0.836×106、3.73×106個/m3空氣(表2)。熒光顯微鏡下觀察,每個視野中被染色的微生物最適為30個～60個(圖1),其微生物數(shù)量過多或過少都會造成計數(shù)的偏差。因此,在顯微鏡下觀察之前必須將采樣液做適當(dāng)?shù)南♂?并且抽濾時選擇合適的樣品量。

2.2 培養(yǎng)計數(shù)方法測得的畜禽舍內(nèi)微生物氣溶膠濃度

AGI-30采樣器對2個雞舍、1個豬舍和2個牛舍內(nèi)微生物氣溶膠(細(xì)菌和真菌)的濃度檢測結(jié)果(中間值)分別為:38.9×105cfu/m3、27.1×105cfu/m3、26.3×105cfu/m3、2.09×105cfu/m3、5.92×105cfu/m3(表2)。對于雞舍A和B,經(jīng)AGI-30采樣器收集樣品后,培養(yǎng)計數(shù)方法測得的濃度僅占DAPI染色計數(shù)法所得濃度的2.34%和1.63%,豬舍C,牛舍D和E經(jīng)培養(yǎng)所得微生物濃度分別占DAPI染色計數(shù)所得濃度的1.93%,2.50%和1.59%。

圖1 DAPI染色后熒光顯微鏡下直接計數(shù)結(jié)果Fig.1 Fluorescence microscope count after DAPI staining

表2 不同畜禽舍微生物氣溶膠的濃度Table 2 Concentration of microbial aerosol in corral and herding sites

3 討論

對復(fù)雜的介質(zhì),由于其中含有使DNA粘連或者抑制酶反應(yīng)的物質(zhì)(如腐質(zhì)酸等),使DNA克隆結(jié)果不能準(zhǔn)確地反映真實情況[12]。使用熒光定量PCR技術(shù)可精確地測定出特定微生物的含量,但該技術(shù)對人員的操作要求較高,價格也比較昂貴,這種技術(shù)適用于對已知特定微生物的定性定量分析[13]。DAPI染色后的直接熒光鏡檢計數(shù)操作簡單,不論是活細(xì)胞,還是死細(xì)胞、殘核細(xì)胞都可以被檢測出來,可得到一個客觀真實的數(shù)據(jù),是對某環(huán)境中微生物總量檢測較為簡捷、有效的方法。

通過本研究可知,雞舍、豬舍和牛舍內(nèi)微生物氣溶膠的總濃度分別為8.0×106～3.25×108個/m3空氣,1.5×107～2.28×108個/m3空氣,9.0×105～5.93×107個/m3空氣;而培養(yǎng)法測得的濃度分別為5.73×105～6.72×106cfu/m3空氣,9.5×105～4.01×106cfu/m3空氣,5.4×104～8.33×105cfu/m3空氣。依靠培養(yǎng)方法所能檢測出的微生物氣溶膠濃度僅為實際濃度的0.04%～10.4%,與Taylor、鄭天凌等使用培養(yǎng)計數(shù)與DAPI染色計數(shù)兩種方法對不同土壤、海水中微生物濃度研究結(jié)果一致[14-15]。

在畜禽舍環(huán)境中,微生物氣溶膠來源和成分非常復(fù)雜,不同微生物種類所需的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)成分不同,因此,通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法所能培養(yǎng)出的微生物數(shù)量及種類很有限。并且,即使可培養(yǎng)的微生物也不一定全部培養(yǎng)出來。因此,傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只能在一定的條件下用于微生物的檢測,難以反映真實的環(huán)境微生物狀況,很大程度上限制了對實驗結(jié)果的判定。

綜上所述,和傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比,DAPI染色計數(shù)法更能準(zhǔn)確客觀地定量養(yǎng)殖環(huán)境中微生物氣溶膠的濃度,為畜禽養(yǎng)殖的科學(xué)管理提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。盡管在采樣過程中未觀察到人和動物的異常表現(xiàn),但是長期暴露于這種環(huán)境中無疑會給人和動物的健康構(gòu)成威脅,因此關(guān)注環(huán)境衛(wèi)生是健康養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)。

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