盛相鵬,杜崇濤,許會會,顧敬敏,雷連成,韓文瑜

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春130062)

緩慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)。該菌被Kloos等在1976年命名為松鼠葡萄球菌緩慢亞種(Staphylococcus sciuri subsp.lentus)[1],并由Schleifer K H等[2]在1983年將其劃分為葡萄球菌屬的一個獨立的種,即緩慢葡萄球菌(S.lentus)。

緩慢葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci,CNS)[1]。CNS曾被認為不具有致病性,但越來越多的資料表明CNS是人類或許多動物不可忽視的致病菌,可引起人類疾病并在醫(yī)院感染中占據(jù)重要地位,尤其對于新生幼兒、存在嚴重基礎疾病或長期接受醫(yī)院治療的病人等免疫力低下的人群更容易導致嚴重的后果[3-7]。由于CNS的多重耐藥問題日益嚴重,CNS引起的感染在國內(nèi)外呈顯著增加的趨勢[5,7-9]。有資料表明,緩慢葡萄球菌曾于山羊乳房[1]、水貂的尿道結(jié)石及尿液[10]、小鼠的角膜[11]及患病動物的環(huán)境中等被分離出來,并被認為可能與動物乳房炎、細菌性角膜炎、醫(yī)院性感染等有密切的聯(lián)系[3,6-8,11]。

但至今,國內(nèi)外對緩慢葡萄球菌的文獻報道較少,其感染時機、致病機理及臨床意義等尚不清楚[3],被用來進行進一步研究的資料和菌種資源也十分有限。本研究從死亡倉鼠中分離鑒定一株緩慢葡萄球菌,并對其進行了初步研究,以期為進一步探討該菌特性、臨床意義及新發(fā)細菌病等提供相關資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自長春地區(qū)某倉鼠養(yǎng)殖場送至本室(微生物與免疫實驗室)的一窩(15只)發(fā)病死亡的倉鼠。

1.1.2 參考菌株 大腸埃希菌O138、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 35218)作為藥敏試驗質(zhì)控菌株,均為微生物與免疫實驗室保存。

1.1.3 實驗動物 18 g～25 g昆明系小鼠,清潔級,5周齡～6周齡左右,購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心。

1.1.4 培養(yǎng)基與試劑盒 LB培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制(Tryptone,Oxoid LP0042;Yeast Extract,Oxoid LP0021;NaCl)國產(chǎn)分析純;Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基MHA為英國Oxoid公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒,凝膠回收試劑盒為愛思進生物技術(杭州)有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要試劑及藥品 氨芐青霉素為Sigma公司產(chǎn)品;限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ),rTaqDNA聚合酶,dNTP Mixture,pMD18-T Simple Vector,均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 15 000為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.6 藥敏紙片 諾氟沙星(NFX)、氧氟沙星、慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、氨芐西林(AMP)、阿米卡星(AK)、多西環(huán)素(DOX),均購自杭州微生物試劑有限公司;克林霉素(DA)、頭孢唑林(KZ)、紅霉素(E)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢西丁(FOX)、左旋氧氟沙星(LEV)、利奈唑胺(LZD)、青霉素G(P)、利福平(RD/RF)、頭孢呋辛(CXM)、復方新諾明(SXT)、頭孢噻肟(CTX)、四環(huán)素(TE)、替考拉寧(T EC)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、萬古霉素(VA),均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.7 主要儀器 Motic BA400生物顯微鏡,Motic公司產(chǎn)品,VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀(全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)),法國生物梅里埃公司產(chǎn)品,PCR擴增儀,德國Biometra公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 在無菌超凈臺內(nèi),剖檢死亡的倉鼠,采集心臟及血液、肺臟、肝臟、腎臟及脾臟。將所采集的各個內(nèi)臟涂布普通LB瓊脂平板,置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18 h～24 h。之后無菌挑取LB平板上的可疑菌落染色鏡檢,并于普通LB液體培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)。

1.2.2 生化鑒定 按照《VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)操作手冊》,用滅菌棉簽沾取大小為2 mm左右純培養(yǎng)的菌苔,并移至4.5 g/L NaCl溶液中,稀釋成約6.5 Mac單位的細菌懸液;然后將細菌懸液填充VITEK-2 GP鑒定卡、孵育,最后在VITEK-2全自動細菌鑒定儀上讀取細菌生化鑒定結(jié)果。

1.2.3 致病性試驗 將分離菌接種于普通LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)8 h后,將培養(yǎng)物倍比稀釋并涂布LB瓊脂平板,進行平板計數(shù)。用無菌生理鹽水將培養(yǎng)物進行稀釋,使細菌終濃度約為1×109cfu/mL。將10只昆明小鼠平均分成兩組(試驗組和對照組),每組5只。在試驗組中,5只小鼠分別腹腔接種細菌懸液200 μ L(約2×108cfu)/只;對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。觀察小鼠的臨床癥狀及活動情況。對死亡小鼠,剖檢后進行細菌分離鑒定。

1.2.4 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer瓊脂擴散法[12]進行藥敏試驗。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸埃希菌(ATCC 35218),抑菌藥物藥敏紙片質(zhì)控合格。質(zhì)控要求、試驗方法及判讀標準均參照美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(2009年版)[13]

1.2.5 PCR鑒定

1.2.5.1 PCR引物設計 在生化試驗初步鑒定為緩慢葡萄球菌后,根據(jù)GenBank發(fā)表的緩慢葡萄球菌的16 S rRNA基因序列(GenBank:FJ795649.1),利用引物設計軟件primer 5.0設計一對特異性引物:

預期擴增片段的大小為446 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.5.2 PCR擴增 以分離菌懸液作為模板,進行PCR擴增。50 μ L PCR反應體系為:ddH2O 38.8 μ L,10×PCR buffer(含Mg2+)5 μ L,dNTP Mixture(25mmol/L)4μ L,上游引物(10 pmol/mL)0.5 μ L,下游引物(10 pmol/mL)0.5 μ L,模板1 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.2 μ L。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃45 s,57℃30 s,72℃1 min,共32個循環(huán);72℃延伸10 min。

同時以大腸埃希菌O138作為陰性對照,以ddH2O作為空白對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5.3 目的片段克隆和基因序列分析 利用凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化并連接到pMD18-T Simple Vector上。連接體系為:SolutionⅠ5 μ L,DNA片段3 μ L,pMD18-T Simple Vector 1 μ L,加ddH2O 1 μ L至終體積為10 μ L。16℃連接18 h后,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,用Amp瓊脂平板進行抗性篩選。利用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒,并經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。鑒定正確的陽性克隆送交北京華大基因研究中心測序,通過NCBI Blast查詢GenBank中的同源序列,進行序列同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

從各個死亡小倉鼠的心臟(及血液)、肺臟、肝臟、腎臟和脾臟中均分離出形態(tài)一致、數(shù)量較多的可疑菌。

2.2 細胞形態(tài)學特征

該分離菌為革蘭陽性球菌,多為散在,也有成對出現(xiàn)或多個聚集(圖1)。

圖1 分離菌的鏡檢形態(tài)(10×100)Fig.1 The microscopic morphology of the isolated strain(10×100)

2.3 培養(yǎng)特性

于普通LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h,形成圓形、邊緣整齊、凸起、光滑濕潤、不透明的灰白色菌落,菌落大小為2 mm左右(圖2)。該種可疑菌在普通LB液體培養(yǎng)基中生長良好、均勻渾濁,管底有少量黏性沉淀。

圖2 分離菌在LB瓊脂平板上生長的菌落形態(tài)Fig.2 Colonies of the isolated strain on solid medium after 24 h of incubation at 37℃

2.3 生化鑒定結(jié)果

VIT EK-2全自動細菌鑒定藥敏儀顯示該菌為緩慢葡萄球菌。通過儀器讀取生化結(jié)果,可知該分離菌對大多數(shù)糖類碳水化合物反應都呈陽性,也可以分解D-山梨醇、D-甘露醇;該菌對酪氨酸、焦谷氨酸反應呈陽性,而對其他氨基酸反應呈陰性;不分解尿素,磷酸酶試驗陽性;對桿菌肽、新生霉素、奧普托欣均耐受。具體生化結(jié)果見表1。該菌觸酶試驗為陽性。

2.4 細菌致病力試驗結(jié)果

試驗組的5只小鼠在腹腔接種分離菌懸浮液(約2×108cfu/只)后的一個星期內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯病變,在第7天至第15天之間,小鼠逐漸變得沉郁、身體卷縮變形,于第15天至第16天死亡。死亡小鼠消瘦、身體明顯畸形,剖檢發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟形狀模糊;從死亡小鼠各個臟器中中分離出緩慢葡萄球菌。而注射生理鹽水的對照組小鼠正常,無任何異常癥狀。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

該分離菌對大多數(shù)抗生素均十分敏感,但對左旋氧氟沙星(LEV)、環(huán)丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NFX)、氧氟沙星等氟喹諾酮類藥物及復方新諾明(SXT)有很強(或較強)的耐藥性(表2)。

表1 分離菌生化試驗結(jié)果Table 1 The result of biochemical assay of the isolated strain

表2 藥敏試驗結(jié)果T able 2 The result of drug sensitivity test

2.6 PCR鑒定結(jié)果

2.6.1 PCR擴增結(jié)果 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,分離菌懸液的PCR產(chǎn)物于約446 bp處獲得目的條帶,片段大小與預期結(jié)果相符;而以大腸埃希菌O138、ddH2O作為模板沒有得到相應條帶(圖3)。

圖3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis for PCR products

2.6.2 測序結(jié)果及序列同源性分析 測序結(jié)果顯示,插入到載體中的目的片段完全符合預期的大小,為446 bp(其中添加的酶切位點共12 bp,真正屬于16 S rRNA基因序列的為434 bp)。NCBI Blast比較結(jié)果顯示,目的序列測序結(jié)果與引物設計參考序列(GenBank:FJ795679.1)及其他緩慢葡萄球菌分離株的16 S rRNA基因序列(GenBank:FJ795683.1、FJ795681.1、FJ795672.1、FJ795671.1、FJ795670.1、FJ795668.1、FJ795656.1、FJ795653.1、FJ795651.1、FJ795649.1(英國愛爾蘭),EU794392.1(智利圣地亞哥),EF528296.1(中國黑龍江)等)同源性為100%。由此可以確定該分離菌株為緩慢葡萄球菌。

3 討論

緩慢葡萄球菌曾被認為是一種以綿羊和山羊為宿主的皮膚及黏膜正常菌群[14],但逐漸增多的資料表明,該菌可能與多種疾病的發(fā)生及臨床感染密切相關[3,6-8,10-11]。

在本研究中,從所有送檢死亡倉鼠的心臟及血液、肺臟、肝臟、腎臟和脾臟中都分離出了緩慢葡萄球菌。由于在發(fā)病倉鼠急性死亡后,立即對其進行剖檢并進行細菌分離鑒定,故排除了倉鼠死亡后緩慢葡萄球菌入侵的可能。由此可知,倉鼠生前就受到該菌感染,之后該菌大量繁殖引發(fā)了菌血癥,并經(jīng)血液循環(huán)侵襲到機體的各個內(nèi)臟器官。而在動物試驗中,該緩慢葡萄球菌可以引起試驗小鼠的慢性死亡(15 d后才死亡),并出現(xiàn)身體消瘦、畸形等臨床癥狀及造成內(nèi)臟器官形態(tài)模糊。這表明該株緩慢葡萄球菌可能具有致病性。但緩慢葡萄球菌在此次倉鼠急性死亡事件中的具體臨床意義尚不清楚,一種可能的推測是該緩慢葡萄球菌引起的菌血癥加劇了其他致病菌的感染,從而造成倉鼠的急性死亡。

防治該菌感染的關鍵在于準確的檢測及有效地用藥。由于細菌的16S rRNA既含有保守序列,又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域;保守區(qū)序列基本恒定,但可變區(qū)序列因細菌種類的不同而發(fā)生變化,其中保守區(qū)反映了生物物種間的親緣關系,而可變區(qū)則表明物種間的差異[15-16]。隨著細菌鑒定研究的深入,16 S rRNA序列分析作為微生物系統(tǒng)分類的主要依據(jù)已得到了廣泛認同,該技術已成為細菌分類和鑒定的一個有力工具[17-18]。因此為了準確地檢測緩慢葡萄球菌,本試驗對緩慢葡萄球菌的16S rRNA基因進行了PCR鑒定及基因同源性比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該緩慢葡萄球菌與英國、智利、中國黑龍江等地區(qū)的緩慢葡萄球菌分離株的16 S rRNA基因同源性達到100%,說明緩慢葡萄球菌雖存在于世界各個地區(qū),但彼此間的基因差異極小。這為通過特異性引物檢測緩慢葡萄球菌提供了依據(jù)。藥敏試驗顯示,該緩慢葡萄球菌對多種抗生素均十分敏感,但對氟喹諾酮類藥物及復方新諾明有很強(或較強)的耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生可能與環(huán)境中抗生素的使用有關,因為復方新諾明與氟喹諾酮類藥物都是常用的廣譜強效抗生素。該緩慢葡萄球菌對復方新諾明及氟喹諾酮類藥物的耐藥機理可能是由于細菌代謝途徑及靶蛋白結(jié)構(gòu)的改變導致藥物失效[19]。用慶大霉素等氨基糖苷類抗生素可以很好地治療該緩慢葡萄球菌引起的感染。

慢葡萄球菌由于與多種疾病密切相關而逐漸引起人們的關注,但至今有關緩慢葡萄球菌的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)緩慢葡萄球菌可以造成倉鼠的全身性菌血癥及可以導致試驗小鼠的慢性死亡,直接證明了其具有致病性。但緩慢葡萄球菌的致病機理及臨床意義仍需進一步研究,這對臨床新發(fā)細菌病的防治及維護公共衛(wèi)生安全有著重要的意義。

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