鞠會艷，高玉偉，楊松濤，夏咸柱＊

（1.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部，長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130062）

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）是急性傳染病-犬瘟熱（Canine distemper，CD） 的病原，CD傳染性強(qiáng)，病率高，常引起大批犬、貂、狐等動物發(fā)病，病死率30%～80%，雪貂高達(dá)100%，經(jīng)濟(jì)損失慘重[1-2]。疫苗接種是預(yù)防CD的有效途徑。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已著手于CDV基因疫苗、亞單位多肽苗和重組活載體疫苗等新型疫苗的研究[3]。

犬瘟熱病毒融合蛋白（F蛋白）是CDV的主要表面糖蛋白，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，F(xiàn)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生[4－5]。因此，選擇F蛋白基因作為目的基因構(gòu)建重組活載體疫苗對預(yù)防犬瘟熱暴發(fā)有十分重要的意義。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所利用長期馴化致弱的CAV-2 SY株構(gòu)建的含CAV-2 SY株全基因組的pPoly2-CAV-2的犬2型腺病毒載體，免疫原性好、安全性好以及良好的遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn)。本試驗以其為載體構(gòu)建表達(dá)犬瘟熱病毒F蛋白基因的重組犬2型腺病毒，為進(jìn)一步研究預(yù)防CD爆發(fā)的重組疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、細(xì)菌和質(zhì)粒

CDV LP株和CAV-2 SY株由本實驗室分離、鑒定和保存；MDCK細(xì)胞、E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞、pPoly2CAV-2載體質(zhì)粒（含CAV-2 SY全基因組）均由本實驗室保存；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVAXΔE3（含CAV-2的E3區(qū)）和真核表達(dá)載體pVAXLPF（含CDV F基因表達(dá)盒）由本實驗室構(gòu)建與保存。

1.1.2 主要試劑

T4DNA連接酶和AMV Reverse Transcriptase（購自Promega公司）；Ex TaqTM、小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）、各種限制性內(nèi)切酶、mRNA提取試劑盒和DNA Blunting kit（購自 TaKaRa公司產(chǎn)品）；AscⅠ（購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（購自Invitrogen公司）；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒（購自Vitagene公司）；鼠抗CDV F蛋白單克隆抗體（本實驗室制備）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（購自Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 酶切DNA片段末端平滑化

用 DNA補(bǔ)平試劑盒（DNA Blunting kit）對MluⅠ和SphⅠ雙酶切后的真核表達(dá)載體pVAXLPF的DNA片段末端進(jìn)行平滑化，以便用平端連接的方法將含F(xiàn)基因的表達(dá)盒克隆入pVAXΔE3的E3區(qū)缺失處。具體操作見DNA補(bǔ)平試劑盒的說明書。

1.2.2 pVAXΔE3的E3區(qū)缺失及DNA片段5′端去磷酸化

由于F基因的表達(dá)盒較大，約為3010bp，因此，用DraⅢ和SspⅠ對pVAXΔE3進(jìn)行雙酶切，對其E3區(qū)缺失了1044bp，以便使pVAXΔE3的E3缺失區(qū)能容納下較大的F基因表達(dá)盒。pVAXΔE3經(jīng)DraⅢ酶切后產(chǎn)生了缺口，所以必須進(jìn)行補(bǔ)平使其末端平滑化，補(bǔ)平、回收后，再用SspⅠ酶切、回收，這樣酶切、回收的pVAXΔE3片段具有平滑末端，便于與平末端的F基因表達(dá)盒連接。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVAXΔE3經(jīng)DraⅢ和SspⅠ酶切、回收后，其5′端需去磷酸化，以防止載體自身連接，從而降低細(xì)菌轉(zhuǎn)化時的背景。

1.2.3 犬瘟熱病毒融合蛋白基因重組腺病毒的構(gòu)建

1.2.3.1 穿梭質(zhì)粒pVAXΔE3LPF的構(gòu)建

真核表達(dá)載體pVAXLPF經(jīng)MluⅠ和SphⅠ雙酶切后，回收目的片段CDV F基因表達(dá)盒（pCMVF-poly（A）），并利用DNA補(bǔ)平試劑盒對該目的片段兩末端進(jìn)行平滑化。轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVAXΔE3經(jīng)DraⅢ酶切、回收后，用DNA補(bǔ)平試劑盒對其末端進(jìn)行平滑化，再用SspⅠ酶切，回收。然后，用小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）對酶切、回收的pVAXΔE3片段5′端去磷酸化。利用T4DNA連接酶，將CDV F基因表達(dá)盒平連到pVAXΔE3的E3區(qū)缺失處，并篩選CDV F基因表達(dá)盒方向與E3區(qū)轉(zhuǎn)錄方向一致的重組子，獲得了含CDV F基因表達(dá)盒的穿梭質(zhì)粒，命名為pVAXΔE3LPF。用多種限制性內(nèi)切酶對所獲得的重組子進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3.2 重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF的構(gòu)建策略為NruⅠ和SalⅠ雙酶切穿梭質(zhì)粒pVAXΔE3LPF后，回收目的基因片段。利用粘端連接方法，在T4連接酶作用下將目的基因片段定向克隆入預(yù)先用NruⅠ和SalⅠ雙酶切骨架質(zhì)粒pPoly2-CAV-2后回收的大片段中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF。用多種限制性內(nèi)切酶分別對重組子pCAV-2-pVAXLPF進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3.3 重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞

重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF經(jīng)AscⅠ酶切后，獲得了線性基因組CAV-2-pVAXLPF。用NruⅠ和SalⅠ分別酶切CAV-2 SY全基因組，用NruⅠ酶切的回收大片段，用SalⅠ酶切的回收小片段。這兩個片段與線性的重組基因組CAV-2-pVAXLPF按摩爾比1∶1∶1混合，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，如果不出現(xiàn)致細(xì)胞病變作用（Cytopathic effect，CPE），則按常規(guī)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每傳1次則重復(fù)轉(zhuǎn)染1次，如果重復(fù)轉(zhuǎn)染5次，仍不出現(xiàn)CPE，則視為轉(zhuǎn)染失敗。如出現(xiàn)CPE，則進(jìn)行常規(guī)病毒增殖，并將獲得的重組病毒命名為CAV-2-pVAXLPF，即為犬瘟熱病毒融合蛋白重組犬2型腺病毒已被成功構(gòu)建。

1.2.4 表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白重組犬腺病毒的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

用第四代重組病毒CAV-2-pVAXLPF接種一瓶單層MDCK細(xì)胞，37℃靜置培養(yǎng)至80%細(xì)胞出現(xiàn)典型的葡萄串樣CPE。取上清用0.5%的磷鎢酸負(fù)染，進(jìn)行電鏡觀察；無菌將細(xì)胞刮下以戊二醛與鋨酸雙固定，用F812環(huán)氧樹脂包埋、切片、染色，作電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.4.2 酶切鑒定

用重組病毒的第四代細(xì)胞培養(yǎng)物接種一瓶MDCK細(xì)胞，37℃靜置培養(yǎng)至80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE，但是仍未脫落，按照提取腺病毒全基因組的方法提取重組病毒的全基因組，用不同的限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4.3 PCR鑒定與表達(dá)盒的克隆測序

根據(jù)GenBank中登錄號為U77082的CAV-2 Toronto A26/61株的E3序列設(shè)計引物，上游引物（E3F）: 5′TGAGGAGAGCATGGACCAGGTGGAG G TGAA3′； 下 游 引 物（E3R）:5′GTCATAATTTGCA GGTAGAGCTCTTCGTGT3′。以重組病毒基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增既含有CDV F基因表達(dá)盒，pVAX載體序列，在兩側(cè)又含有E3區(qū)的部分序列的核酸片段。將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳?；厥誔CR產(chǎn)物，將其克隆入pMD18-T載體中，利用不同的限制性內(nèi)切酶對重組子進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的重組子送上海聯(lián)合基因生物公司進(jìn)行序列測定。

1.2.5 重組病毒中犬瘟熱病毒融合蛋白表達(dá)的檢測

1.2.5.1 F基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測

用第4代重組病毒接種一瓶MDCK細(xì)胞，置37℃溫箱培養(yǎng)35 h，棄上清，用mRNA提取試劑盒提取mRNA，將提取的mRNA用F基因引物進(jìn)行RT-PCR，以檢測F基因是否轉(zhuǎn)錄。同時，用CAV-2感染的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對照。

1.2.5.2 F蛋白表達(dá)的檢測

色譜柱：SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.75%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[14]。

用第4代重組病毒接種一瓶MDCK細(xì)胞，同時用CAV-2接種另一瓶MDCK細(xì)胞作為陰性對照。37℃靜置培養(yǎng)至大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)CPE，但是仍未脫落，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，并用0.01 mol·L-1pH 7.2的PBS溶液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以除去培養(yǎng)液中的血清蛋白。然后，加入適量的PBS液，反復(fù)凍融3次，5000 r·min-1離心10 min，棄去細(xì)胞碎片，收集上清液。將上清用Millipore公司生產(chǎn)的超濾離心管除鹽和濃縮；取濃縮產(chǎn)物10μL與等體積的2×上樣緩沖液混勻100℃煮沸5 min，用10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot分析。一抗為鼠抗CDV F蛋白單克隆抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為第二抗體。

1.2.6 重組病毒CAV-2-pVAXLPF遺傳穩(wěn)定性

將重組病毒CAV-2-pVAXLPF接種MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳代至第30代時分別對第5、10、15、20、25和 30代重組病毒 CAV-2-pVAXLPF的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定重組病毒CAV-2-pVAXLPF的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬瘟熱病毒融合蛋白重組犬腺病毒的構(gòu)建

2.1.1 犬瘟熱病毒F基因表達(dá)盒的回收

含犬瘟熱病毒F蛋白的真核表達(dá)載體pVAXLPF經(jīng)MluⅠ和SphⅠ雙酶切后，切出大小約3010、1270和730bp的3個片段（見圖1），其中第2泳道3010bp的DNA片段即為要回收的CDV F基因表達(dá)盒片段。進(jìn)行凝膠電泳回收目的片段CDV F基因表達(dá)盒（pCMV-F-polyA）（見圖2），第1泳道的DNA片段即為已回收的CDV F基因表達(dá)盒。

2.1.2 穿梭質(zhì)粒pVAXΔE3LPF的酶切鑒定

CDV F基因表達(dá)盒被連接到轉(zhuǎn)移載體pVAXΔE3的E3區(qū)缺失處，獲得了CDV F基因表達(dá)盒方向與E3區(qū)轉(zhuǎn)錄方向一致的穿梭質(zhì)粒pVAXΔE3LPF。該質(zhì)粒經(jīng)NruⅠ和SalⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、PstⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ分別酶切鑒定。NruⅠ和SalⅠ雙酶切后得到大小為6112、2400和1315bp的3個片段，其中6112bp的片段即為要回收的含CDV F基因表達(dá)盒的片段；HindⅢ切出大小為6728、1574、913和612bp的4個片段；Eco RⅤ酶切后得到大小為6553和3274bp的2個片段；PstⅠ酶切后得到大小為6269和3558bp的2個片段；KpnⅠ酶切后得到大小為4336、2999和2492bp的3個片段；XbaⅠ酶切后得到大小為4294、3200和2333bp的3個片段（見圖3）。酶切鑒定結(jié)果與利用DNAStar軟件計算的理論值一致，表明穿梭質(zhì)粒pVAXΔE3LPF已被成功構(gòu)建。

圖1 真核表達(dá)載體pVAXLPF的酶切Fig.1 Enzyme digestion of pVAXLPF

圖2 犬瘟熱病毒F蛋白基因表達(dá)盒的回收Fig.2 The extraction of CDV F expression cassette

圖3 pVAXΔE3LPF質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of pVAXΔE3LPF plasmid by restriction endonuclease digestion

2.1.3 重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF的酶切鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶酶切后，NruⅠ和SalⅠ雙酶切后得到大小為29176bp和含CDV F基因表達(dá)盒的6113bp的2個片段；經(jīng)PvuⅠ、SalⅠ和AscⅠ分別單酶切后，將重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF線性化；其余各種限制性內(nèi)切酶如KpnⅠ、Bam HⅠ、EcoR V、PstⅠ、XhoⅠ、HindⅢ及KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后，得到的DNA片段的數(shù)量及大小皆與理論值一致（見圖4），表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF正確。

2.1.4 重組病毒CAV-2-pVAXLPF的包裝

重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF經(jīng)AscⅠ酶切后，獲得了線性基因組CAV-2-pVAXLPF，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，重復(fù)轉(zhuǎn)染3次后，正常的MDCK細(xì)胞（見圖5）出現(xiàn)典型的CAV-2樣CPE，開始時細(xì)胞圓腫發(fā)亮，逐漸聚集成葡萄串樣，最后從瓶壁上脫落。表明重組基因組CAV-2-pVAXLPF轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞成功，已獲得重組病毒CAV-2-pVAXLPF（見圖6），犬瘟熱病毒融合蛋白重組犬腺病毒構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pCAV-2-pVAXLPF的酶切鑒定Fig.4 Identification of pCAV-2-pVAXLPF plasmid by restriction endonuclease digestion

圖5 正常MDCK細(xì)胞（100×）Fig.5 Normal MDCK cell(100×)

圖6 重組病毒CAV-2-pVAXLPF引起的MDCK 細(xì)胞病變（100×）Fig.6 Cytopathic effects of CAV-2-pVAXLPF in MDCK cell(100×)

2.2 犬瘟熱病毒融合蛋白重組犬腺病毒的鑒定

2.2.1 重組病毒CAV-2-pVAXLPF形態(tài)學(xué)觀察

利用第5代重組病毒CAV-2-pVAXLPF的上清作電鏡負(fù)染觀察，可看到20面立體對稱、直徑約80nm、表面具有排列整齊殼粒的腺病毒樣粒子（見圖7）。在感染細(xì)胞超薄切片中，細(xì)胞核內(nèi)可見有呈排列整齊的晶格樣病毒粒子，與腺病毒形態(tài)學(xué)完全相符（見圖8）。

圖7 CAV-2-pVAXLPF的負(fù)染電鏡照片（80000×）Fig.7 Photograph of CAV-2-pVAXLPF negatively stained in electron microscopy(80000×)

圖8 CAV-2-pVAXLPF的電鏡超微結(jié)構(gòu)照片（40000×）Fig.8 Ultramicroscopic structure photograph of CAV-2-pVAXLPF in electron microscopy(40000×)

2.2.2 重組病毒CAV-2-pVAXLPF基因組酶切鑒定

利用各種限制性內(nèi)切酶對提取的第5代重組病毒CAV-2-pVAXLPF全基因組進(jìn)行酶切鑒定，用NruⅠ和SalⅠ雙酶切后可得大小為23903、6113和3273bp的3條DNA片段；KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切與分別單酶切以及Bam HⅠ、HindⅢ分別單酶切所獲得的DNA片段的數(shù)量及大小皆與與理論值一致，表明構(gòu)建的重組病毒正確（見圖9）。

圖9 CAV-2-pVAXLPF病毒基因組的酶切鑒定Fig.9 Identification of CAV-2-pVAXLPF virus genosome by restriction endonuclease digestio

2.2.3 重組病毒CAV-2-pVAXLPF PCR擴(kuò)增鑒定及其產(chǎn)物序列測定

重組病毒CAV-2-pVAXLPF的PCR擴(kuò)增表明以提取的重組病毒基因組DNA為模板，用CAV-2 E3特異性引物擴(kuò)增出3677bp大小片段（第3泳道），該片段經(jīng)回收、純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明該序列中包含CAV-2 E3區(qū)相關(guān)序列、pVAX1相關(guān)序列和CDV F基因序列，表明所構(gòu)建的重組病毒CAV-2-pVAXLPF完全正確（測序結(jié)果略）。而正常CAV-2只能擴(kuò)增出1500bp大小片段（第4泳道）；用CDV F基因特異性引物從重組病毒DNA中擴(kuò)增出2000bp大小的F基因片段（第2泳道），而正常的CAV-2擴(kuò)增結(jié)果為陰性（第1泳道）（見圖 10）。

圖10 重組病毒CAV-2-pVAXLPF PCR擴(kuò)增鑒定Fig.10 Identification of recombinant virus CAV-2-pVAXLPF by PCR

2.3 犬瘟熱病毒融合蛋白在重組犬腺病毒中表達(dá)的檢測

2.3.1 重組病毒中F基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測

以CDV F基因特異性引物用RT-PCR法從重組病毒CAV-2-pVAXLPF的mRNA中擴(kuò)增出F基因特異性片段，F(xiàn)基因片段大小為2000bp（第2泳道），而從正常CAV-2感染的MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增的結(jié)果為陰性（見圖11）。

2.3.2 重組病毒CAV-2-pVAXLPF中F蛋白表達(dá)的檢測

利用Western blot方法檢測了重組病毒CAV-2-pVAXLPF中F蛋白的表達(dá)。以預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為參照標(biāo)準(zhǔn)，以便在轉(zhuǎn)膜后能清晰看到分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)條帶。試驗結(jié)果表明重組病毒CAV-2-pVAXLPF表達(dá)的F蛋白可被抗CDV F蛋白的單克隆抗體所識別，表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約為72 ku，與預(yù)期的分子質(zhì)量相符，而正常的腺病毒陰性對照卻無此特異性條帶（見圖12）。

圖11 重組病毒CAV-2-pVAXLPF中F基因轉(zhuǎn)錄的檢測Fig.11 F gene transcription identification of CAV-2-pVAXLPF

圖12 重組病毒CAV-2-pVAXLPF表達(dá)的F蛋白Fig.12 Expresstion F protein of recombinant virus CAV-2-pVAXLPF

2.4 重組病毒CAV-2-pVAXLPF的遺傳穩(wěn)定性

對重組病毒CAV-2-pVAXLPF第5、10、15、20、25和30代MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果均可從重組病毒CAV-2-pVAXLPF基因組中擴(kuò)增出大小約2000bp的CDV F基因片段，表明該病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性（見圖13）。

圖13 重組病毒CAV-2-pVAXLPF的遺傳穩(wěn)定性Fig.13 Genetic stability of recombinant virus CAV-2-pVAXLPF

3 討論

3.1 CDV融合蛋白基因（F基因）作為目的基因的選擇

在CDV的結(jié)構(gòu)蛋白中，F(xiàn)蛋白位于病毒的表面，是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要糖蛋白，在病毒免疫中占有重要地位。F蛋白上存在著兩個重要的輔助性T淋巴細(xì)胞表位，此輔助性T淋巴細(xì)胞表位可能是犬抗原提呈細(xì)胞（APCs）最優(yōu)先識別和提呈的位點(diǎn)[6]。與Onderstepoort弱毒疫苗株F蛋白含有4個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)相比，本試驗的CDV LP野毒株推導(dǎo)的F蛋白氨基酸序列中含有5個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，其中108～110位氨基酸殘基上所形成的潛在糖基化位點(diǎn)是CDV LP野毒株擁有而Onderstepoort弱毒株所沒有的。與Onderstepoort弱毒株相比，CDV LP野毒株在105～115位和365～375位氨基酸處有明顯Jameson-Wolf抗原表位優(yōu)勢，這種抗原表位差異顯示CDV LP毒株F蛋白的免疫原性可能要優(yōu)于Onderstepoort弱毒株[7]。另外，在麻疹病毒成員中，F(xiàn)蛋白為異型免疫的主要交叉抗原。F蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制疾病的發(fā)生[8]。因此，本試驗選擇CDV LP毒株F蛋白全基因作為目的基因，利用犬2型腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱病毒融合蛋白的重組腺病毒，旨在表達(dá)的F蛋白能對犬起到免疫、保護(hù)作用，在一定程度上抵抗CDV對犬的攻擊。

3.2 CAV-2 E3區(qū)的缺失對病毒復(fù)制和包裝的影響

CAV-2 E3區(qū)全長1491bp，位于CAV-2腺病毒基因組的24920～26411bp處，包括兩個ORF即 ORF1（24920-25279bp） 和 ORF2（25317-26411bp）。E3區(qū)編碼的蛋白質(zhì)與病毒逃避宿主免疫監(jiān)視機(jī)制有關(guān)，可減弱感染細(xì)胞被機(jī)體免疫識別的幾率，然而刪除E3區(qū)對病毒感染卻沒有明顯的影響。E3區(qū)是腺病毒生長非必需區(qū)，對E3區(qū)進(jìn)行缺失可以增加插入的外源DNA的容量，缺失或取代E3區(qū)的腺病毒仍能夠在細(xì)胞上生長，所以E3區(qū)常被用來作為外源基因的插入位點(diǎn)，插入外源基因構(gòu)建重組疫苗。若將CAV-2 E3區(qū)全部缺失，以HAd5腺病毒載體為例進(jìn)行計算，則CAV-2外源基因的容量可達(dá)3.0 kb左右。然而，E3區(qū)全部缺失可能會對CAV-2的復(fù)制與包裝產(chǎn)生不利的影響。從目前報道來看，構(gòu)建CAV-2重組病毒時并未將E3區(qū)全部缺失。由于CAV-2 E3區(qū)缺失的大小直接影響其容納外源基因的容量，因此須盡可能最大限度地缺失E3區(qū)，然而，對E3區(qū)可缺失DNA片段的最大極限還不十分清楚。但顯然不能延續(xù)到位于E3區(qū)側(cè)翼的結(jié)構(gòu)蛋白基因，因為E3區(qū)側(cè)翼序列的缺失可能會影響其上下游蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而影響CVA-2的復(fù)制或包裝[9-10]。本試驗插入E3區(qū)的F基因表達(dá)盒較大，約為3010bp。因此，采用了DraⅢ和SspⅠ對pVAXΔE3進(jìn)行雙酶切，對其E3區(qū)缺失了1044bp，以便使pVAXΔE3的E3缺失區(qū)能容納下較大的F基因表達(dá)盒。本試驗中表達(dá)CDV F基因的重組腺病毒成功構(gòu)建證明了對CAV-2 E3區(qū)缺失1044bp后，并未影響位于E3區(qū)側(cè)翼的結(jié)構(gòu)蛋白基因，也沒有影響CAV-2的復(fù)制與包裝。

4 結(jié)論

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞方法，成功構(gòu)建了含CDV LP株融合蛋白基因的重組犬腺病毒CAV-2-pVAXLPF。并通過Western blot證實重組病毒CAV-2-pVAXLPF能夠表達(dá)CDV F蛋白，其蛋白分子質(zhì)量為72 ku。而且，重組病毒在MDCK細(xì)胞中連續(xù)傳30代后，仍含有F基因，表明重組病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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