喬紅杰,王貴平,李春玲*

(1.廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所,廣東廣州510640;2.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510640;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州510640)

金蕎麥(Fagopyrum dibotrys)是我國民間的一種常用中草藥,塊根入藥,性平、微涼、味苦、酸澀,在我國古代就已經(jīng)用于治療各種疾病。后經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)及臨床研究表明,金蕎麥根具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。楊體模等[1]在金蕎麥E對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響中指出,口服金蕎麥E不僅能顯著提高正常小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬指數(shù),而且能減輕化療時(shí)氟脲嘧啶和CTX誘導(dǎo)的小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能低下的副作用,同時(shí)還能提高荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬指數(shù)。印德賢等[2]也證實(shí)金蕎麥具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。但是之前的試驗(yàn)研究多采用體內(nèi)試驗(yàn)方法,而體內(nèi)試驗(yàn)操作困難,結(jié)果不易觀察。為了使體外反應(yīng)系統(tǒng)相對接近藥物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的真實(shí)過程,增強(qiáng)中藥試驗(yàn)研究的可信性和科學(xué)性,本試驗(yàn)選用20世紀(jì)80年代興起的血清藥理學(xué)方法(即體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)結(jié)合的一種方法),用服藥后的金蕎麥根含藥血清代替中藥進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng),檢測其對雞脾T、B淋巴細(xì)胞增殖活性的影響及其作用的時(shí)-效、量-效關(guān)系,以期闡明金蕎麥根的免疫藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 嶺南黃雞,60日齡,雌性,平均體重1.5 kg±0.2 kg,購自廣東省農(nóng)科院畜牧研究所養(yǎng)雞場。

1.1.2 主要儀器 DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測儀為國營華東電子管廠產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為美國Revco公司產(chǎn)品;XSZ-DZ型倒置顯微鏡為重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品;75-2A型微量振蕩器為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為德國Nunclon公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 RPM I-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,新生牛血清為Gibco公司產(chǎn)品,谷氨酰胺為E.Merk公司產(chǎn)品,ConA和LPS為Sigma公司產(chǎn)品,MTT為Sigma公司產(chǎn)品,二甲基亞砜為天津化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品,1×104μg/mL青鏈霉素為北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 600mL/L的乙醇金蕎麥根提取物的制備 金蕎麥根用萬能粉碎機(jī)粉碎后,粗粉過40目后在室溫下用60 mL/L的乙醇以料液比1∶30的比例浸泡,密封放置7 d,收集浸泡液,經(jīng)紫外分光光度法測定其總黃酮含量之后,濃縮為生藥含量2 g/mL。

1.2.2 含藥血清的制備 動(dòng)物的分組及給藥處理見表1。

表1 動(dòng)物的分組及處理Table 1 Animal＇sg rouping and disposal

空白組灌胃等體積的生理鹽水,試驗(yàn)組以600 mL/L乙醇金蕎麥根提取物每天6、24、40 g/kg,1 d劑量分為2次給藥,連續(xù)給藥14 d,每組最后1次灌胃后40、80、120、180 min經(jīng)翅靜脈采血,分離血清,經(jīng)56℃、30 min滅活,并用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 參照文獻(xiàn)[3],取兩月齡母雞,頸靜脈放血處死,無菌取出脾臟,用滅菌生理鹽水沖洗3次,置盛有5mL～10 mLHank's液平皿的200目銅網(wǎng)上,用注射器內(nèi)芯輕輕捻碎,使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入Hank's液中,收集細(xì)胞液,并移吸至一無菌刻度離心管中400 r/m in離心8 min,除去紅細(xì)胞,移吸上清液轉(zhuǎn)入另一無菌刻度離心管中,2 500 r/min離心15m in,吸棄上清液,Hanks液洗2遍,鏡下細(xì)胞記數(shù),用完全RPM I-1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1.0×107個(gè)/mL,制成單細(xì)胞懸液。

1.2.4 血清不同添加量對雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(M TT法) 以給藥14 d的中劑量組的120 min的含藥血清為材料,研究血清不同添加量對雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。于96孔培養(yǎng)板中每孔依次加入100μL脾淋巴細(xì)胞懸液,第1組:100μL含40μg/mL ConA及不同體積的試驗(yàn)血清的培養(yǎng)液;第2組:100μL含20μg/mL LPS及不同體積的空白血清的培養(yǎng)液;第3組:100μL不同體積的含藥血清和空白血清的培養(yǎng)液。在39℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h～6 h每孔加入5μg/mL的M TT溶液10μL,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔中吸取180μL的上清液,再加入150μL的二甲基亞砜,充分振蕩后靜置20 m in后,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm下的吸光度,作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo),重復(fù)上述試驗(yàn)3次。

1.2.5 雞脾淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)及測定(M TT法) 參照文獻(xiàn)[4],于96孔培養(yǎng)板中每孔依次加入100μL脾淋巴細(xì)胞懸液,第1組:100μL含40μg/mL的ConA及50 mL/L的供試血清的培養(yǎng)液;第2組:100μL含20μg/mL的LPS及50 mL/L的供試血清的培養(yǎng)液;第3組:100μL含50 mL/L的供試血清的培養(yǎng)液,39℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h～6 h每孔加入5μg/mL的M TT溶液10μL,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔中吸取180μL的上清液,再加入150μL的二甲基亞砜,充分振蕩后靜置20m in后,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm下的吸光度,作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo),重復(fù)上述試驗(yàn)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 計(jì)算4孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)據(jù)以Means±SD表示,并用SPSS軟件進(jìn)行Duncan＇s多重分析,比較T和B淋巴細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 血清不同添加量對雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

結(jié)果見表2。當(dāng)血清添加量在0～2.5 mL/L之間時(shí),隨著血清添加量的增加,OD值隨之增大,但當(dāng)血清添加量大于2.5 mL/L時(shí),OD值反而降低,表明在體外培養(yǎng)體系中含藥血清的添加量在2.5mL/L為最好。

表2 血清不同添加量對雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Table 2 The influence of different serum add it ion son the proliferation of spleen lymphocytes in chicken

2.2 不同劑量和時(shí)相的金蕎麥根含藥血清對雞脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空白組相比,40 min時(shí)的3個(gè)劑量組的含藥血清對淋巴細(xì)胞增殖作用影響不明顯;80m in時(shí)的3個(gè)劑量組的含藥血清對促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用有明顯提高;120 min時(shí)的3個(gè)劑量組的含藥血清促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用極其明顯;180m in時(shí)的3個(gè)劑量組的含藥血清促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用開始降低,呈明顯的時(shí)-效關(guān)系。

同一時(shí)相、不同劑量組的含藥血清對淋巴細(xì)胞增殖活性的影響不同,與相應(yīng)時(shí)相的空白血清相比,3個(gè)劑量組的含藥血清都能促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞增殖,且中劑量組含藥血清對淋巴細(xì)胞的增殖作用明顯高于低劑量組和高劑量組的含藥血清。

含藥血清+ConA組的OD值顯著高于ConA組及相應(yīng)的血清對照組(P＜0.05或P＜0.01),而含藥血清+LPS組的OD值顯著高于LPS組(P＜0.05或P＜0.01),但與相應(yīng)的血清對照組相比(120m in時(shí)的含藥血清組除外),則差異不顯著(P＞0.05)(表3)。

表3 不同劑量和時(shí)相的金蕎麥根含藥血清對雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Table 3 The effects of different doses and time of serum containing Fagop yrum dibotry son the proliferation of spleen lymphocytes in chicken

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,金蕎麥根中含有豐富的黃酮、多糖、皂苷類等生物有效成分[5-6],這些成分不但有助于動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)、免疫器官的活化,也有助于提高T、B淋巴細(xì)胞功能[7]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫,是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞,與雞的免疫防疫體系密切相關(guān)[8];B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫,是免疫應(yīng)答的輔佐細(xì)胞。因此,T、B淋巴細(xì)胞的活化有助于提高動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。

中藥血清藥理學(xué)是中草藥藥效學(xué)研究的一種重要方法,它以含藥血清代替?zhèn)鹘y(tǒng)的中藥粗提物進(jìn)行體外藥理實(shí)驗(yàn),不但有利于避免直接中藥實(shí)驗(yàn)中的一系列干擾,而且能較準(zhǔn)確地反映中藥的藥效和作用機(jī)制[9]。而中藥含藥血清的制備則是中藥血清藥理學(xué)研究方法的核心部分,為了減少因種屬差異而造成的免疫反應(yīng)[10],采用和體外培養(yǎng)的細(xì)胞同源的動(dòng)物雞作為血清供體動(dòng)物;為了使含藥血清中的血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)[11],根據(jù)藥動(dòng)學(xué)理論和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,將給藥方案設(shè)計(jì)為每天給藥2次和連續(xù)給藥14 d;為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更好地反映金蕎麥根的藥理學(xué)活性,設(shè)立了空白血清對照組和確定了體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),含藥血清的最佳添加濃度為25 mL/L,而較高濃度血清會(huì)對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用,這和國內(nèi)的報(bào)道相一致[12]。

本試驗(yàn)以此方法為手段,從細(xì)胞分子水平對金蕎麥根的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了研究。綜合試驗(yàn)研究結(jié)果可以看出:①金蕎麥根含藥血清與空白血清組相比,金蕎麥根含藥血清促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用明顯,表明金蕎麥根經(jīng)動(dòng)物機(jī)體代謝后,對正常雞脾T、B淋巴細(xì)胞具有增殖活性的有效成分,且在服藥后2 h左右這種活性成分作用最強(qiáng),但這些活性成分作用維持時(shí)間較短,服藥后3 h就逐漸消失,這對指導(dǎo)臨床用藥及金蕎麥根的研究開發(fā)提供了一定的參考價(jià)值。②不同劑量的含藥血清對雞脾T、B淋巴細(xì)胞活性的影響也呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系,且中劑量組為最高,高劑量組低于中劑量組,表明高劑量組的含藥血清表現(xiàn)出了一定的藥理毒性作用,這對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。

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