宋永峰 周 麗 鐘錦倫 宋延華 溫納相

（廣東溫氏食品集團研究院 新興 527400）

番鴨細小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

宋永峰 周 麗 鐘錦倫 宋延華 溫納相*，

（廣東溫氏食品集團研究院 新興 527400）

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的番鴨細小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列，應用DNAstar分子生物學軟件設(shè)計1對引物，應用PCR技術(shù)擴增MDPV XX株的結(jié)構(gòu)蛋白基因VP2全基因片段。將擴增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy載體上，經(jīng)菌液PCR鑒定后的重組子進行序列測定。結(jié)果表明，MDPV XX株基因大小為1764bp，編碼587個氨基酸，其基因序列與國內(nèi)外發(fā)表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分別為98.4%和99.8%，而與同屬的小鵝瘟病毒B株核苷酸同源性僅為78.2%?？梢娋幋a番鴨細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VP2基因較保守，且和同屬的小鵝瘟病毒明顯不同，這也是該病毒目前只有一個血清型的分子基礎(chǔ)。

番鴨細小病毒 VP2基因 克隆 序列分析

*通訊作者

番鴨細小病毒(MDPV)病是近年來在國內(nèi)外番鴨養(yǎng)殖中普遍流行的一種急性敗血性傳染病[1-3]。該病以番鴨消化道，尤其是小腸的病變?yōu)橹饕卣鳎瑐鞑タ?，發(fā)病率、死亡率都很高，是造成番鴨養(yǎng)殖中經(jīng)濟損失的主要傳染病之一[4]。

其病原—MDPV為細小病毒科細小病毒屬成員，為單股、線性DNA病毒。基因組大小約為5kb，編碼區(qū)含有2個開放閱讀框架(ORF)[5]，其中右側(cè)ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,即VP1 、VP2 、VP3。三者共用同一終止密碼子，起始密碼子各不相同，其分子質(zhì)量由大到小排列依次為VP1 、VP2 、VP3[6-8]。其中VP2 結(jié)構(gòu)蛋白具有免疫原性，是病毒刺激機體產(chǎn)生保護性抗體的重要抗原蛋白[9]。MDPV-XX株是從具有典型臨床癥狀和病理變化的雛番鴨體內(nèi)分離得到的野毒, 本研究克隆了MDPV-XX 株VP2基因，并與GenBank中收錄的MDPV FM株、GD株，GPV B株進行了核苷酸同源性比較，為進一步研究MDPV的分子生物學特性和VP2基因的生物學活性等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒

MDPV新興株(Xinxing，XX)由本實驗室分離自某發(fā)病番鴨群，病鴨表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，軟腳，呼吸困難，拉灰白色或淡綠色糞便；剖檢可見回腸膨大，內(nèi)含大量炎性滲出物或脫落的腸黏膜。

1.2 載體與菌株

PGEM-Teasy載體克隆試劑盒購自TaKaRa公司，感受態(tài)細胞JM109、DH5α由本實驗室制備并保存。

1.3 試劑

Tissue DNA Kit 購自O(shè)MEGA公司，Premix TaqTM (Ex TaqTM Version)、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工，X-gal、IPTG購自Promega公司，常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純產(chǎn)品。

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)已發(fā)表的MDPV參考毒株FM株、GD株等毒株的全基因序列，利用DNAstar軟件設(shè)計1對擴增VP2全基因的引物MDPVF/R，預期擴增片段大小為1764bp。上游引物MDPVF：5'-ATGGCTCCTGCTAAAAAG -3'，下游引物MDPVR：5'–GGCGAAATTTACAGATTCTGAGTC -3'，引物由Invitrogen合成。

1.5 DNA提取、PCR擴增

按照Tissue DNA Kit說明書操作從樣品中提取DNA，以DNA為模板進行PCR擴增，25μl反應體系如下：12.5μl Premix Taq、8.5μl ddH2O、MDPVF/ R 各1μl 、2μl DNA模板。PCR擴增條件：95℃ 5mins,94℃ 50s,42℃ 50s,72℃90s,30個循環(huán)，72℃ 10mins。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析鑒定。

1.6 目的基因的克隆與鑒定

用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將所得的PCR純化產(chǎn)物與pGEM-T easy 載體按照說明書操作進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，藍白斑篩選重組子。挑取白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中進行過夜培養(yǎng)，常規(guī)方法進行菌液PCR鑒定。

1.7 目的基因序列測定

將菌液PCR鑒定為陽性的含重組質(zhì)粒的菌液送往大連寶生物公司進行序列測定。

1.8 序列分析

利用DNAstar分子生物學軟件，將測出的核苷酸序列與GenBank已發(fā)表的MDPV及GPV參考毒株序列進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

應用引物MDPVF/R對MDPV XX分離株核酸進行PCR擴增，結(jié)果可以擴增到大小約為1800bp的特異性條帶，與預期結(jié)果相符（見圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將目的基因克隆到pGEM-T easy 載體中，挑取白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基（Amp+）中進行過夜培養(yǎng),常規(guī)方法進行菌液PCR鑒定。結(jié)果應用PCR可以擴增到一條約為1800bp的特異性條帶(見圖2)，說明MDPV-XX株 VP2基因已經(jīng)被成功克隆。

2.3 序列測定及分析比較

測序結(jié)果表明:MDPV XX株VP2 基因大小為1764 bp,編碼588個氨基酸。應用DNAstar軟件將MDPV-XX株VP2基因序列與MDPV參考毒株FM株、GD株及GPV參考毒株B株VP2基因進行核苷酸同源性比較，發(fā)現(xiàn)MDPV-XX株VP2基因與MDPV FM株相比，有29個核苷酸發(fā)生改變，并使14個氨基酸發(fā)生改變；與MDPV GD株相比，有4個核苷酸發(fā)生改變，使3個氨基酸發(fā)生改變；其核苷酸同源性分別為98.4%和99.8%，對應的氨基酸同源性為97.2%和99.3%。而與同屬的GPV參考毒株B株的核苷酸同源性僅為78.2%，對應的氨基酸同源性為87.6%（見圖3）。

圖1 MDPV XX株 VP2基因PCR擴增

圖2 菌液PCR鑒定

圖3 MDPV-XX株與MDPV FM株、GD株,GPV B株VP2基因推導的的氨基酸序列比較

3 討論

（1）VP2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是病毒刺激機體產(chǎn)生保護性抗體的重要蛋白抗原[9]。2000年，婁華等[10]首次對番鴨細小病毒的抗原性蛋白基因進行序列測定。筆者根據(jù)genBank 中發(fā)表的MDPV基因序列，應用DNAstar軟件設(shè)計一對VP2基因擴增引物MDPVF/R，應用PCR技術(shù)成功獲得了MDPVXX株VP2基因并亞克隆到PGEM-Teasy載體中，為下一步研究VP2基因的結(jié)構(gòu)、功能奠定了基礎(chǔ)。

（2）MDPV XX株VP2 基因大小為1764 bp，應用DNAstar軟件進行序列分析，MDPV XX株VP2基因與國內(nèi)外MDPV分離株FM株、GD株核苷酸同源性非常高，分別達到98.4%和99.8%，這說明番鴨細小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因保守性較高，這也使目前該病毒只有一個血清型的分子基礎(chǔ)。而與同屬的GPV參考毒株B株的核苷酸同源性僅為78.2%，具有明顯不同。

[1] B W 卡爾尼克松, 禽病學[M].第11版.[出版社不祥]2005.

[2] Takehara K,Hyakutake K,Imamura T,et al. Avi.Dis.,1994,38:810-15.

[3] 殷震,劉景華. 動物病毒學[M]. 第2版,北京:科學出版社,1997.

[4] Glavits R,Zolnai A,Szabo E,et al. Comparative pathological studies on domestic geese (Anser anser domestica) and Muscovy ducks (Cairina moschata) experimentally infected with parvovirus strains of goose and Muscovy duck origin[J]. Acta Vet Hung,2005, 53(1): 73-89.

[5] 季芳，張毓金，楊增岐等.番鴨細小病毒和鵝細小病毒廣東株VP1基因的克隆與序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2004,26(4):245-246.

[6] Le Gall-Recule G,Jestin V.Biochemical and genomic characterization of Muscovy duck parvovirus[J].Arch Virol,1994,139:121-131.

[7] 陳曉月，趙承輝，章金剛等.番鴨細小病毒國內(nèi)分離株主要結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆和序列分析[J].中國家禽,2006,28(24):9-12.

[8] Chun-Yen CHU ,Ming-Jeng PAN ,Jiin-Tsuey CHENG.Genetic Variation of the Nucleocapsi of Waterfowl Parvovirus[J].J Vet Med Sci ,2001 ,63 (11):1165-1170.

[9] Wang C Y,Shieh H K,Shien J H,et al. Expression of capsid proteins and non- structural proteins of waterfowl parvoviruses in Escherichia coli and their use in serological assays[J]. Avian Pathol, 2005, 34(5):76-82.

[10] 婁華，白挨泉，顧萬軍等.番鴨細小病毒MDPV-Q株VP2蛋白基因的克隆與序列測定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2001,23(1):4-6.

S852.65+9.2

A

1007-1733(2010)04-0003-03

2009–12–23）

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