蒲 軍,丘 彥

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.附屬第一醫(yī)院輔助生殖中心 400016）

近20年隨著現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的發(fā)展,特別是自1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）技術(shù)的應(yīng)用,使得男性不育的治療效果發(fā)生了顯著變化。眾多的不育男性通過ICSI技術(shù)獲得了自己的后代。但精液精子、附睪精子及經(jīng)睪丸取得的精子進(jìn)行ICSI治療的臨床效果有無區(qū)別,是臨床普遍關(guān)注的問題。為此,本文總結(jié)了自2006年1月至2008年12月到重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輔助生殖中心就診的89例嚴(yán)重少弱畸形精子癥及無精子癥患者的臨床資料,比較了精液精子、附睪精子和睪丸精子進(jìn)行ICSI治療的臨床效果,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 所有患者夫婦二人均在該生殖中心就診,經(jīng)檢查確認(rèn)符合衛(wèi)生部規(guī)定的進(jìn)行ICSI的條件。男方年齡27～41歲（平均36.5歲）,原發(fā)不育55例,繼發(fā)不育34例。排除女方不孕因素、吸煙、助孕前為提高精子活力接受藥物治療的患者。嚴(yán)重少弱畸形精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：男方3次精液常規(guī)檢查至少有2次以上符合以下任一標(biāo)準(zhǔn)者,即一次射精的精子密度小于1×106/mL；a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子活力小于1%；按嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)檢查,正常形態(tài)精子率小于1%?；蚰蟹?次精液常規(guī)檢查至少有2次以上同時(shí)滿足精子密度小于5×106/mL,a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子活力小于10%,按嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)檢查,精子正常形態(tài)率小于5%。無精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)為3次射出的精液經(jīng)離心沉淀后鏡檢均未見精子。無精子癥患者在行ICSI前均進(jìn)行診斷性經(jīng)皮附睪穿刺取精或經(jīng)皮睪丸穿刺取精證實(shí)為梗阻性無精癥,嘗試各種外科治療方法均失敗。所有患者血清中性激素水平及染色體核型檢查及Y染色體微缺失的檢查均未見異常。按下列條件進(jìn)行分組,精液精子組：嚴(yán)重少弱畸形精子癥患者38例經(jīng)手淫法或性交法取精；附睪精子組：共21例,包括15例嚴(yán)重少弱畸形精子癥患者在取卵日經(jīng)各種方法嘗試不能取精后采用經(jīng)皮附睪穿刺獲得精子及6例梗阻性無精子癥患者采用經(jīng)皮附睪穿刺獲得精子；睪丸精子組：共30例,包括20例梗阻性無精子癥患者經(jīng)皮附睪穿刺取精失敗及10例嚴(yán)重少弱畸形精子癥患者采用常規(guī)方法及經(jīng)皮附睪穿刺取精失敗后經(jīng)皮睪丸穿刺獲得精子。3組在女方年齡、不孕年限、身體狀況等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精液精子、經(jīng)皮附睪及睪丸穿刺獲取精子與采卵同日上午進(jìn)行,下午行ICSI。

1.2 治療方法

1.2.1 精液精子獲取方法 禁欲3～7d,采用手淫法或性交中斷法取出精液,離心沉淀。

1.2.2 經(jīng)皮附睪穿刺取精方法 患者取仰臥位,常規(guī)消毒、鋪巾,1%利多卡因行穿刺點(diǎn)局麻及精索神經(jīng)阻滯麻醉。用7號(hào)針頭、5mL注射器吸取精子培養(yǎng)液約0.3mL,左手固定一側(cè)睪丸和附睪,右手將注射器經(jīng)皮膚穿刺進(jìn)入附睪頭部,將注射器拉至5mL以上位置形成負(fù)壓,同時(shí)退出針頭直至針頭離開附睪。若未見附睪液抽出可重復(fù)多次穿刺。將抽吸的附睪液連同精子培養(yǎng)液注入小培養(yǎng)皿,在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)的成熟精子。如有精子,將抽出液離心沉淀備用。如兩側(cè)附睪多次穿刺均未發(fā)現(xiàn)精子,可考慮行睪丸穿刺取精術(shù)。

1.2.3 經(jīng)皮睪丸穿刺取精方法 體位及麻醉方法同附睪穿刺取精。術(shù)者用左手牢固固定一側(cè)睪丸于皮下,用12號(hào)針頭、10mL注射器進(jìn)行穿刺,右手握注射器經(jīng)皮膚穿刺進(jìn)入睪丸白膜內(nèi),將注射器拉至6mL以上位置形成負(fù)壓,持續(xù)保持注射器負(fù)壓的同時(shí)慢慢退出針頭直至針頭離開陰囊皮膚,由助手持小鑷夾取被吸出陰囊皮膚的曲細(xì)精管并注入盛有精子培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下尋找形態(tài)良好的精子。如找不到精子,可改變進(jìn)針方向進(jìn)行多點(diǎn)穿刺。必要時(shí)可進(jìn)行睪丸活檢術(shù)獲取精子。

1.2.4 促超排卵 用果納芬或HMG促超排卵,B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育,當(dāng)有2～3個(gè)卵泡發(fā)育到直徑超過18mm以上時(shí),肌注絨毛膜促性腺激素10000u促進(jìn)卵子成熟,36h后采用B超介導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞,加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中準(zhǔn)備進(jìn)行ICSI。

1.2.5 其他 ICSI、原核及胚胎評(píng)分、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、黃體支持、妊娠診斷、監(jiān)測(cè)及隨訪方法均按參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行處理,受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均數(shù)結(jié)果采用 t檢驗(yàn),種植率、妊娠率采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

精液精子、附睪精子及睪丸精子進(jìn)行ICSI治療的臨床效果見表1。

表1 3種取精方式的精子進(jìn)行ICSI治療的臨床效果比較（%±s）

表1 3種取精方式的精子進(jìn)行ICSI治療的臨床效果比較（%±s）

組別 n 受精率 優(yōu)胚率 種植率 妊娠率精液精子組 38 74.78±0.19 44.72±0.25 23.56 35.21附睪精子組 21 71.38±0.21 51.52±0.27 25.93 38.13睪丸精子組 30 78.66±0.18 48.17±0.28 22.54 34.21P＞0.05 ＞0.05 ＞0.05＞0.05

3 討論

1992年世界首例ICSI“試管嬰兒”的誕生,標(biāo)志著男性不育癥的治療達(dá)到了一個(gè)新的里程碑。ICSI技術(shù)改變了自然的受精過程,使精卵細(xì)胞無需經(jīng)歷復(fù)雜的生理受精過程,通過直接將精子注入卵細(xì)胞內(nèi),從而形成受精胚胎。該技術(shù)對(duì)精子數(shù)量、活力、受精能力的要求極低,使得在以前被認(rèn)為毫無辦法的大部分男性不育患者有了生育的希望。

隨著ICSI技術(shù)的不斷應(yīng)用和發(fā)展,大大降低了輔助生殖技術(shù)對(duì)精子的質(zhì)量及數(shù)量的要求。因而相繼出現(xiàn)了多種從附睪及睪丸獲取精子的方法,并成功獲得妊娠?，F(xiàn)在臨床上廣泛采用的經(jīng)皮附睪或睪丸穿刺獲取精子的方法簡(jiǎn)單易行,創(chuàng)傷小,并發(fā)癥少。本研究中的51例患者均成功的由附睪或睪丸獲取足夠數(shù)量的精子行ICSI,且無1例發(fā)生感染、血腫等并發(fā)癥。

精子在睪丸的曲細(xì)精管管壁產(chǎn)生。精子的形成要先后經(jīng)歷精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子等5個(gè)階段。精子形成后進(jìn)入曲細(xì)精管管腔,被動(dòng)運(yùn)輸至附睪,附睪內(nèi)的精子進(jìn)一步成熟并獲得運(yùn)動(dòng)和受精能力。性高潮時(shí)精子隨精漿被排出體外。由于精液精子、附睪精子及睪丸精子的生理功能存在區(qū)別,因而會(huì)擔(dān)心3種不同方法獲取的精子進(jìn)行ICSI治療后其臨床助孕效果可能會(huì)有差異。本研究結(jié)果顯示3組精子進(jìn)行ICSI治療后其受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,與文獻(xiàn)報(bào)道相似[2-4]。這說明附睪的精子,特別是睪丸的精子盡管成熟度低,但借助ICSI仍然可以獲得較高的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率及妊娠率,其ICSI的臨床治療效果與精液精子相當(dāng)。由于精液精子、附睪精子、睪丸精子的生理功能存在區(qū)別,因此3種取精方法獲取的精子在正常生理狀態(tài)下的受精效果必然存在差別。但I(xiàn)CSI技術(shù)改變了受精過程,克服了在正常情況下能導(dǎo)致受精失敗的精子形態(tài)、活動(dòng)力和其他方面的缺陷,使自然情況下不能穿過透明帶的、活動(dòng)力差的精子獲得受精、卵裂及妊娠[5]。這可能是精液精子、附睪精子、睪丸精子進(jìn)行ICSI治療的臨床助孕效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因。

同時(shí)應(yīng)該注意到由于ICSI是將單個(gè)的精子直接注射到卵細(xì)胞內(nèi),受精的精子沒有經(jīng)過自然選擇的過程,可能使AZF基因缺陷人為地遺傳給下一代[6]。因此,對(duì)嚴(yán)重少精及無精子癥患者行ICSI治療前進(jìn)行AZF基因位點(diǎn)缺失的篩查、進(jìn)行胚胎種植前遺傳學(xué)診斷及選擇性移植女性胚胎進(jìn)而阻斷遺傳途徑是必要的。本組患者進(jìn)行ICSI治療前進(jìn)行染色體核型分析及Y染色體微缺失的檢查未發(fā)現(xiàn)異常。

總之,本研究結(jié)果表明,精液精子、附睪精子、睪丸精子進(jìn)行ICSI治療的妊娠結(jié)局相似,精子的成熟度可能不影響ICSI治療的臨床效果。但精液精子、附睪精子、睪丸精子進(jìn)行ICSI治療的遠(yuǎn)期臨床效果及對(duì)個(gè)體出生后的影響,有待進(jìn)一步研究。

[1]羅亞寧,張順,李麗,等.經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)結(jié)合單精子卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注射技術(shù)治療梗阻性無精子癥[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29（11）：1031.

[2]羅開玲,鄧志華,丘映,等.精液精子、附睪精子和睪丸精子卵胞漿內(nèi)單精子注射助孕結(jié)局的比較[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25（2）：275.

[3]Buffat C,Patrat C,Merlet F,et al.ICSI outcomes in obstructive azoospermia：influence of the origin of surgically retrieved spermatozoa and the cause of obstruction[J]. HuMReprod,2006,21（4）：1018.

[4]Moghadam KK,Nett R,Robins JC,et al.The motility of epididymal or testicular spermatozoa does not directly affect IVF/ICSI pregnancy outcomes[J].J Androl,2005,26（5）：619.

[5]Alukal JP,Lamb DJ.Intracytoplasmic sperm injection（ICSI）-what are the risks[J].Urol Clin North Am,2008,35（2）：277.

[6]Feng C,Wang LQ,Dong M Y,et al.Assisted reproductive technology may increase clinical mutation detection in male offspring[J].Fertil Steril,2008,90（1）：92.