郭炳彥,石英輝,韓 瑞,韓德榮,李擁軍

心肌肥大是以心肌體積增加和蛋白質含量增多為主要特征的生長異常,是引起多種心血管疾病的危險因素之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)與多種生長因子均可促使心肌肥大的發(fā)生和發(fā)展,細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在其中起著關鍵作用[1]。姜黃素是植物姜黃的主要成分,其藥理學研究已有百年歷史,姜黃素具有抗炎、抗氧化、降血脂和抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[2-4],臨床上可用于冠心病的治療。但其對心肌肥大的作用報道較少。本實驗用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞研究姜黃素對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大及ERK表達的影響,探討姜黃素此作用的可能機制,為其在臨床用于防治心肌肥大提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 出生1 d～3 d Sprague-Dawley大鼠,河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供,清潔級,質量許可證號:SCXK(冀)2008-1-003,雌雄不限;DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國),AngⅡ(Sigma公司,美國),胰蛋白酶(Sigma公司,美國),膠原酶Ⅱ(Invitrogen公司,美國),ERK1/2抗體(購自武漢博士德公司),姜黃素(北京博奧森生物技術有限公司生產,純度大于 95.5%),其他試劑為分析純產品。

1.2 新生大鼠心肌細胞培養(yǎng) 取1 d～3 d新生Sprague-Dawley大鼠,在超凈工作臺上常規(guī)手術取心室肌組織,用4℃D-Hanks液洗凈殘血,將心室肌剪碎,用0.1%胰蛋白酶加0.04%膠原酶Ⅱ連續(xù)消化成單細胞懸液,所有心肌細胞原液經(jīng)200鉬細胞篩過濾,差速貼壁1.5 h,將未貼壁的心肌細胞用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×108/L,并加入0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌細胞增殖,然后將細胞均勻地接種于 6孔培養(yǎng)板,每孔2 mL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,然后換無血清培養(yǎng)液。

1.3 實驗分組 乳鼠心肌細胞于無血清DM EM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,分成 3組,對照組、AngⅡ組(10-6mol/L)、姜黃素組(AngⅡ10-6mol/L+姜黃素2.5×10-8g/L)。

1.4 心肌細胞蛋白合成速率測定 心肌細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后,加入各種干預因素和18.3 kBq[3H]-亮氨酸繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。棄培養(yǎng)液,PBS沖洗3遍,用 0.1%胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上,用10%的三氯乙酸固定,濾膜烘干后用LS-3810液體閃爍儀測定摻入量。

1.5 心肌細胞蛋白的提取 終止細胞培養(yǎng),將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出,用預冷PBS洗培養(yǎng)物3次,棄去PBS。用細胞刮棒刮培養(yǎng)孔底部,將貼壁細胞刮下來用冰PBS收集以1 500 r/min～3 000 r/min離心6 min～10 min,去上清。向沉淀加入心肌細胞裂解液100 μ L和 PMSF 1μL,冰上裂解30 min,每10 min吹打一次。12 000 r/min離心15 min,移上清于1 mL的EP管中,-80℃冰箱保存。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測ERK1/2蛋白表達 用Bio-Rad的蛋白定量試劑盒測蛋白濃度,完畢后將之加入5×SDS加樣緩沖液中煮沸5min,以使蛋白質樣品變性,然后置于-80℃凍存?zhèn)溆?。?2%十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白,用電轉移方式將蛋白轉移至硝酸纖維膜上,用含5%脫脂奶粉的 TBST封閉1 h,加入一抗(1∶1 000),4℃過夜,次日用 TBST洗 3次后,加入二抗(1∶2 000),孵育1 h,TBST洗3次,ECL發(fā)光,壓膠片曝光,對所得條帶進行掃描。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 11.0軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析,兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞蛋白合成速率 AngⅡ組(2 282.32 cpm±245.48 cpm)較對照組(1 313.64 cpm±202.58 cpm)顯著增加(P＜0.01),姜黃素組(1 761.62 cpm±212.44 cpm)較 AngⅡ組顯著降低(q=48.42,P＜0.01)。

2.2 各組心肌細胞 ERK1/2的表達 AngⅡ組ERK1/2(456.5±8 3.3)表達較對照組顯著增加(190.5±25.3,θ=35.14,P＜0.01),而姜黃素組較AngⅡ組顯著降低(216.2±19.6,θ=19.64,P＜0.01)。

3 討 論

血管緊張素Ⅱ作為一個重要的神經(jīng)內分泌因子,不僅能夠控制心血管系統(tǒng)的生理功能,對心肌肥大或心力衰竭的病理生理過程也能起到至關重要的作用。MAPK通路是一條重要的胞內信號轉導通路,參與AngⅡ誘導的心肌肥大反應[5]。它主要包括ERK、應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK)、p38MAPK 3種;ERK途徑是細胞生長、分化與存活等過程的重要信號轉導機制,其中ERK1/2與心肌細胞肥大關系最為密切[6],ERK主要由Raf通過Ras激活,磷酸化ERK是其活化形式。其活化后轉位到核內,作用于下游的轉錄因子 ELK、AP-1、NF-κ B等,調節(jié)引起心肌肥大相關的基因(如c-fos、c-myc、c-jun)的轉錄。研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可誘導ERK磷酸化,從而活化ERK通路引起心肌肥大反應的發(fā)生。延緩由細胞外信號引起的肥大進程是任何控制肥大的治療措施的關鍵[7]。姜黃素是從植物姜黃、郁金、莪術等植物根莖中提取的一種生物多酚化合物。具有行氣破血、消積止痛、清心解郁等功效。具有抗氧化和清除自由基、抗血小板、調節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抑制血栓形成等廣泛的藥理作用,并且具有肝臟及腎臟保護功能,毒副反應小。姜黃素還可改善壓力超負荷兔的心功能[8]。因而推測姜黃素在治療心力衰竭等心血管疾病方面有著廣泛的應用前景。

本研究結果顯示,AngⅡ可顯著增加新生大鼠心肌細胞蛋白合成速率,而姜黃素可顯著抑制心肌細胞蛋白合成速率,說明姜黃素可抑制AngⅡ所致的心肌細胞肥大。AngⅡ可顯著增加心肌細胞ERK1/2的表達,姜黃素使ERK1/2表達顯著降低,說明姜黃素可能通過降低胞內信號轉導分子ERK1/2的表達,實現(xiàn)防止心肌細胞肥大的作用。下一步研究要著重于姜黃素對ERK信號通路的上下游分子的影響,進一步闡明姜黃素抗心肌肥厚的機制,為其在臨床用于心肌肥厚的防治提供實驗依據(jù)。

姜黃素可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞核內信息分子ERK1/2的表達,這可能是姜黃素抗心肌肥大的重要機制之一。

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