趙保路

中國科學(xué)院生物物理研究所，腦與認(rèn)知國家重點實驗室，北京 100101

自由基、天然抗氧化劑與神經(jīng)退行性疾病

趙保路

中國科學(xué)院生物物理研究所，腦與認(rèn)知國家重點實驗室，北京 100101

神經(jīng)退行性疾病，老年癡呆癥（Alzheimer's disease，AD）、帕金森癥（Parkinson's Disease，PD）和中風(fēng)（腦卒中）嚴(yán)重危害老年人的身體健康和生活質(zhì)量。這些疾病的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，也無有效治療方法。目前的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧和NO自由基在誘導(dǎo)細胞的凋亡和導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病AD、PD和中風(fēng)方面發(fā)揮了重要作用。該文章綜述了神經(jīng)退行性疾病的自由基機理和天然抗氧化劑對這些疾病的預(yù)防和治療作用機理。天然抗氧化劑，如茶多酚，能夠防止6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的細胞凋亡，保護線粒體功能從而預(yù)防6-OHDP誘導(dǎo)大鼠的PD癥狀；大豆異黃酮和尼古丁作為抗氧化劑可以防止Amyloid-β（Aβ）誘導(dǎo)的海馬細胞凋亡和轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ的沉積，抑制6-OHDA誘導(dǎo)細胞凋亡過程線粒體細胞色素C釋放。在轉(zhuǎn)基因鼠海馬CA1區(qū)的Aβ斑中，銅、鐵濃度比周圍神經(jīng)明顯增高，用尼古丁處理明顯減少海馬CA1區(qū)Aβ斑及其周圍神經(jīng)中銅和鐵的濃度，尼古丁可以抑制分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活，核因子 -κB（Nuclear factor kappa B， NF-κB） 和致癌基因蛋白（Myc codes for a protein that binds to the DNA of other genes，C-Myc）的活化，使一氧化氮合酶和一氧化氮生成下調(diào)，尼古丁介導(dǎo)的神經(jīng)信號通路過程受乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，α7 nAChRs）調(diào)控。研究還發(fā)現(xiàn)山楂黃酮通過抑制活性氧和調(diào)節(jié)一氧化氮自由基可以預(yù)防和治療中風(fēng)。這些結(jié)果為神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)理論研究和臨床實踐提供了新的思路和實驗依據(jù)。

自由基；天然抗氧化劑；神經(jīng)退行性疾??；帕金森癥；老年癡呆癥；中風(fēng)

0 引 言

最新人口普查表明，現(xiàn)在我國60歲以上的老年人口有1.3億，我國已經(jīng)提前步入老齡化社會。到2050年將達到4.39億，占總?cè)丝诘?/4。老年性癡呆和帕金森氏病的患病人數(shù)已達1500萬以上。人口老齡化和老年變性疾病對社會、家庭和醫(yī)學(xué)界造成巨大的壓力和負(fù)擔(dān)。目前其發(fā)病機制尚不完全清楚，也無有效治療方法，是一個嚴(yán)重的社會問題。研究發(fā)現(xiàn)自由基在引起老年退行性疾病過程中是一個重要因素，天然抗氧化劑在預(yù)防和治療老年退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。

目前研究結(jié)果表明，自由基在體內(nèi)具有重要的生物功能，例如，氧自由基在線粒體呼吸鏈的電子傳遞、細胞的分化生長、免疫反應(yīng)，一氧化氮自由基在血管的舒張、血壓的調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)和記憶等方面發(fā)揮了重要作用。但是，自由基又幾乎和人類大部分常見的幾種主要疾病都有關(guān)系，從人類死亡率最高的心腦血管疾病，到人類最可怕的癌癥，以及衰老和老年神經(jīng)退行性疾病，無一不和自由基有著密切關(guān)系[1～3]。本文目的在于綜述目前對神經(jīng)退行性疾病 (老年癡呆癥、帕金森綜合癥和中風(fēng))的自由基機理和天然抗氧化劑預(yù)防和治療機理的研究進展，從自由基生物學(xué)的角度給出一些與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)不同的關(guān)于老年神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)識，以利于尋求新的預(yù)防和治療方法。

1 自由基與神經(jīng)退行性疾病發(fā)病

老年癡呆癥（Alzheimer's disease，AD）、帕金森癥（Parkinson's disease,PD）和中風(fēng)的發(fā)病機理是復(fù)雜和多因素的。來自于父母的基因在決定是否罹患AD、PD和中風(fēng)的過程中或許起了一定的作用，但只是少數(shù)，大部分的AD、PD和中風(fēng)病例其實都是散發(fā)性的，它們不具有家族遺傳性。衰老肯定是引起AD、PD和中風(fēng)的一個重要因素。氧化應(yīng)激和自由基損傷是導(dǎo)致亞健康并引發(fā)AD、PD和中風(fēng)的重要因素?！把趸瘧?yīng)激”或“自由基失衡”是指體內(nèi)產(chǎn)生的自由基增多，而清除自由基的能力降低（抗氧化酶活性減弱或抗氧化劑濃度降低），體內(nèi)就會有多余的自由基，從而損傷細胞成分[4]。

1.1 自由基與老年癡呆癥

老年癡呆癥，即阿爾茨海默氏病，是由德國精神病理學(xué)家Alos Alzheimer于1907年首先報告的。阿爾茨海默病有奇怪的行為癥狀，開始喪失短時記憶，逐漸表現(xiàn)出語言障礙，變得糊涂、妄想、情緒激動，臨終時會大小便失禁、臥床不起并忘卻了一切。解剖尸體顯示，大腦由于神經(jīng)元缺失而萎縮，且充滿纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊。

大量活性氧自由基的產(chǎn)生以及能量代謝障礙是許多衰老相關(guān)疾病的特征，AD也不例外。AD病人腦中表現(xiàn)出異常高的氧化修飾蛋白、脂類和DNA水平，這些自由基介導(dǎo)的分子損傷在淀粉樣斑和神經(jīng)纏結(jié)包圍的神經(jīng)元周圍環(huán)境里尤其重要。這也暗示了氧化應(yīng)激在Amyloid-β（Aβ）介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷以及神經(jīng)纖維纏結(jié)病理化進程中的作用。AD中幾種來源的氧化應(yīng)激均已有報道，其中Aβ和具有氧化還原活性的幾種金屬離子，比如Fe2+和Cu+，是比較常見的來源[5]。在Aβ聚集產(chǎn)生過氧化氫過程中，都有活性氧的生成，這可能是Fe2+和Cu+參與的結(jié)果。Aβ誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化通過乙醛基-4-壬烯共價結(jié)合破壞了ATPases、葡萄糖和谷氨酸轉(zhuǎn)運體，以及GTP結(jié)合蛋白。在細胞內(nèi)鐵代謝和能量代謝失衡情況下，相當(dāng)?shù)偷难趸瘧?yīng)激水平就可以導(dǎo)致神經(jīng)元對細胞外毒性和調(diào)亡的敏感。AD中突觸功能障礙以及退行性改變或許就包含了Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激因素，因為Aβ可以通過破壞膜上離子和谷氨酸轉(zhuǎn)運體的功能，同時通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)機制威脅到線粒體的功能。越來越多的研究表明，AD和氧化應(yīng)激有很強的相關(guān)性?；罨男∧z質(zhì)細胞是活性氧和一氧化氮自由基的來源，β淀粉樣蛋白通過肽酰自由基產(chǎn)生活性氧自由基，在過渡金屬離子存在時多糖末端與β淀粉樣蛋白受體作用產(chǎn)生活性氧，過氧化氫和超氧自由基，引起細胞膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化[6]。

最近的研究證明，線粒體異常和缺陷導(dǎo)致產(chǎn)生的活性氧自由基是AD發(fā)病的一個重要因素[7]。線粒體功能紊亂是與AD發(fā)病機制相關(guān)的關(guān)鍵細胞內(nèi)損傷，而且最新的研究提出，線粒體可能是Aβ的一個重要靶點[8～10]。為了闡明AD發(fā)病前期Aβ導(dǎo)致線粒體損傷的具體機制，以及線粒體損傷在AD發(fā)病機制中的作用，我們采用轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型和轉(zhuǎn)基因AD細胞模型，對線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)表達的變化，以及線粒體數(shù)量、形態(tài)和功能的變化進行了系統(tǒng)的研究，旨在尋找對AD的早期診斷有幫助的細胞與分子標(biāo)志，以及預(yù)防、治療AD的新靶點，并進一步探索AD的發(fā)病機制。我們的研究發(fā)現(xiàn)：1）超氧陰離子在神經(jīng)細胞中能夠調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白 2（uncoupling proteins2，UCP2）和解偶聯(lián)蛋白 4（uncoupling proteins4，UCP4）的蛋白質(zhì)水平，并且線粒體自由鈣離子水平的變化與解偶聯(lián)蛋白水平的變化緊密偶聯(lián)。當(dāng)UCP2和UCP4通過siRNA被沉默后，這種結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明超氧陰離子能夠通過調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白的表達來調(diào)節(jié)線粒體自由鈣離子水平。2）激光共聚焦顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)突變APP基因的細胞中線粒體比對照線粒體有大幅度腫脹，線狀形態(tài)線粒體減少，球狀線粒體數(shù)量增多[11]。這些發(fā)現(xiàn)也提示解偶聯(lián)蛋白可能是預(yù)防與治療AD的潛在靶點，線粒體可能是AD發(fā)病的一個早期重要因素。

1.2 自由基與帕金森癥

PD是老年人群中發(fā)病率很高的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為選擇性的黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的減少、喪失，以及黑體-紋狀體束的病理性改變，從而引起運動障礙，以僵直、震顫、運動遲緩為主要臨床特征。目前發(fā)病機制一般認(rèn)為是由于中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死，使通過黑質(zhì)紋狀體通路作用于紋狀體的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）減少，造成紋狀體內(nèi)多巴胺和乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）兩種遞質(zhì)的平衡失調(diào)而發(fā)病。黑質(zhì)神經(jīng)元消失具有特殊分布區(qū)，主要在致密帶。所有受損區(qū)除神經(jīng)元脫失外，還伴有膠質(zhì)細胞增生，殘存的色素細胞亦可出現(xiàn)色素減少或色素外溢，部分細胞出現(xiàn)Lewy body，可觀察到β-synuclein和ubiquitin形成的直徑7～12 nm的纖維[1]。PD的致病因素有遺傳和環(huán)境兩種，前者占大約30%，后者占大約70%。

環(huán)境因素包括一些環(huán)境產(chǎn)生的神經(jīng)毒劑，如6-OHDA、MTPT、除草劑、魚藤酮等，它們都會引起多巴胺神經(jīng)元的損傷甚至凋亡。這些神經(jīng)毒劑引起多巴胺神經(jīng)元損傷和凋亡的共同特征是通過氧化應(yīng)激，即產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）。神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺可以通過化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)產(chǎn)生ROS。人腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)金屬離子鐵的含量較高，與過氧化氫反應(yīng)生成過量活性氧自由基，攻擊生物大分子，消耗抗氧化物質(zhì)，破壞了細胞的抗氧化防御系統(tǒng)，增加了細胞的氧化應(yīng)激。更為嚴(yán)重的是氧化還原平衡的破壞，進一步導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏?，呼吸衰竭，產(chǎn)生能量危機，形成氧化應(yīng)激和線粒體損傷的反饋循環(huán)，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元過度的損傷和缺失，產(chǎn)生PD的臨床癥狀。

氧化應(yīng)激在PD發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。腦組織的氧代謝率很高，同時抗氧化劑的保護機制又相對缺乏，這就導(dǎo)致腦組織的ROS代謝相對容易失去平衡。線粒體是ROS敏感的細胞器之一，過量的ROS不僅影響線粒體“能量工廠”的正常功能，而且還能反饋性增加ROS和RNS的產(chǎn)生，釋放凋亡因子細胞色素C，激活Caspases蛋白家族，導(dǎo)致細胞凋亡。許多環(huán)境因素和代謝毒素都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的ROS及RNS，從而引起不同程度的細胞毒性作用。過量的ROS及RNS不僅可以影響細胞膜的通透性，引起Ca2+內(nèi)流和細胞第二信使含量的升高，還能激活多條氧化還原通路。大量證據(jù)表明，在PD的發(fā)病過程中，活性氧與各種突變蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)了蛋白的纖維沉積，促進神經(jīng)元凋亡，甚至死亡[11,12]。

大量研究表明，過量的一氧化氮（NO）可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。在病理條件下，ROS和NO的產(chǎn)量都大大增加，二者極易發(fā)生反應(yīng)生成過氧亞硝基。過氧亞硝基是強氧化劑，可以與蛋白的巰基反應(yīng)，或者硝基化芳香族氨基酸，影響它們在信號傳導(dǎo)中的功能。此外，過氧亞硝基可以氧化脂類、蛋白質(zhì)和DNA，從而破壞其功能。NO還可與Fe配基反應(yīng)，使Fe（Ⅲ）通過與NO結(jié)合而還原，產(chǎn)生的Fe2+-NO+，進一步與細胞內(nèi)的巰基反應(yīng)，使其亞硝基化[13]。NO還參與了PD病多巴胺能神經(jīng)元的降解[14]。

目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激過度是導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性和殘存神經(jīng)元進一步損傷的重要原因。通過化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)，多巴胺代謝能產(chǎn)生活性氧自由基。多巴胺自氧化能導(dǎo)致醌類、半醌類及其它活性氧產(chǎn)生，最終形成神經(jīng)黑色素（neuromelatonin）。更重要的是，多巴胺在單胺氧化酶的作用下形成過氧化氫和其降解產(chǎn)物L(fēng)-3,4-二羥苯丙氨酸和高藜蘆酸。過量的過氧化氫在與過渡金屬鐵反應(yīng)中生成反應(yīng)活性更強的OH·，從而增加細胞的氧化應(yīng)激，消耗抗氧化物質(zhì)和破壞細胞的抗氧化防御系統(tǒng)[15]。

線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁粑ソ?，會引起氧化?yīng)激增強并產(chǎn)生能量危機。尸體檢查的另一個發(fā)現(xiàn)是，30%～40%的PD病人線粒體復(fù)合物酶Ⅰ（complexⅠ）的酶活力和免疫染色降低。線粒體復(fù)合物酶Ⅰ功能的缺失導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈的受阻和電子泄漏，產(chǎn)生過量的活性氧自由基，氧化磷酸化脫偶聯(lián)，ATP產(chǎn)生減少，細胞的還原力下降。最終表現(xiàn)為DA神經(jīng)元的降解和缺失[16]。在神經(jīng)退行性疾病當(dāng)中，線粒體功能紊亂是一個重要現(xiàn)象。尤其是在PD當(dāng)中，對于線粒體活力下降的研究更是一個長期探討的話題，因為在對PD病人腦部尸檢當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的一個非常重要現(xiàn)象，就是嚴(yán)重的線粒體活力下降和氧化損傷。而在實驗動物和人當(dāng)中，很多能夠?qū)е翽D癥狀的藥物，如1-甲基-4-苯基-四羥嘧啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyriding，MPTP）等，其最終作用位點也是在線粒體上。

在PD研究當(dāng)中，用于造成腦部黑質(zhì)紋狀體區(qū)域損傷以構(gòu)建PD動物模型所用的幾個主要神經(jīng)毒劑，包括MPP+（MPTP的活性代謝產(chǎn)物）、6-羥多巴、魚藤酮和百草枯等，都是線粒體復(fù)合物Ⅰ的特異性抑制劑，而且目前認(rèn)為它們主要抑制位點都在魚藤酮的特異性結(jié)合位點上。這就進一步在PD與線粒體復(fù)合物Ⅰ之間架起了一道橋梁。上述的各種神經(jīng)毒劑與復(fù)合物Ⅰ結(jié)合后都會產(chǎn)生一系列的細胞內(nèi)效應(yīng)，并最終導(dǎo)致細胞的死亡。以MPP+為例，一方面，MPP+的加入直接導(dǎo)致了線粒體膨脹與PT孔道的開放，引起細胞色素C和AIF從線粒體內(nèi)釋放到胞漿；另一方面，MPP+進入線粒體后與復(fù)合物Ⅰ結(jié)合，在這里它抑制了ATP的合成并刺激ROS的生成，進一步導(dǎo)致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破，從而造成DNA損傷并引發(fā)一系列凋亡途徑的激活。其中包括原癌基因氨基端激酶/原癌基因（c-Jun N-terminal kinases/c-Jun is the name of a gene and protein that,in combination with c-Fos,forms the AP-1 early response transcription factor，JNK/c-Jun）磷酸化p53，誘導(dǎo)Bax合成和轉(zhuǎn)位至線粒體；同時誘導(dǎo)多 (腺苷二磷酸核糖）聚合酶 〔Poly(adenosine diphosphate ribose)polymerase，PARP〕活化。Bax和PARP共同作用于線粒體，同樣導(dǎo)致了細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）的泄漏。在胞漿中，細胞色素C加入了caspase介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)使細胞進入凋亡途徑，而AIF則介導(dǎo)了另外一個沒有Caspase參與的凋亡途徑。當(dāng)然，這些理論都有待完善，因為目前的實驗結(jié)果還有很多相互矛盾的地方。比如，MPP+是能夠直接導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ上自由基生成增加，還是通過介導(dǎo)細胞內(nèi)多巴或者還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD(P)H）的氧化生成自由基？ATP合成的下降未必是致命的，因為細胞還可以通過糖酵解途徑提供足夠的能量，復(fù)合物Ⅰ提供電子導(dǎo)致合成減少的ATP能夠迅速被補償性恢復(fù)[17]。

1.3 中風(fēng)和自由基

中風(fēng)的死亡率僅次于心臟病和癌癥，列于死亡病因的第三位，同時中風(fēng)還是成年人最主要的致殘性疾病[18]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國中風(fēng)的發(fā)病率比美國等發(fā)達國家還高，每年新發(fā)中風(fēng)的病人大約是200多萬人，高于世界平均水平。近年來，隨著工業(yè)化和生活水平的提高還有上升的趨勢。隨著我國老齡化社會的到來，中風(fēng)將會給社會造成沉重的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)。因此，研究中風(fēng)的發(fā)病機理、預(yù)防手段和治療藥物是我國面臨的重要課題。

中風(fēng)是由腦部血液循環(huán)系統(tǒng)障礙引起的，又分為不同的種類，主要為：缺血性中風(fēng)、顱內(nèi)出血性中風(fēng)和蛛膜出血性中風(fēng)等幾種。中風(fēng)病人中80%是缺血性中風(fēng)，是由于血管的阻塞引起的。大腦是體內(nèi)耗氧量最大的器官之一，數(shù)分鐘的缺血就會對大腦造成不可逆的損傷，因此必須盡快恢復(fù)血液供應(yīng)，但是當(dāng)用溶栓藥物打開阻塞恢復(fù)血液循環(huán)時，常常造成進一步的損傷，即缺血再灌注損傷。研究缺血再灌注損傷的機理和預(yù)防手段，對于有效地治療中風(fēng)，減輕家庭和社會壓力有重要的意義。中風(fēng)引起的血管性癡呆是僅次于AD的第二大癡呆病因，它是成年人長期殘疾的主要病因。隨著人口老齡化的到來，中風(fēng)引起的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)不斷加重，使治療和預(yù)防中風(fēng)成為新千年中面臨的最重要的公共健康課題之一。因此，研究中風(fēng)的致病機理，以及治療和預(yù)防途徑，有重要的理論意義和社會價值。

大腦是人體中耗氧量最大的器官，在中風(fēng)過程中血管阻塞，大腦得不到氧氣和能量供應(yīng)，在很短的時間內(nèi)就會死亡。常規(guī)的治療辦法是利用溶栓藥物打開血管，但是血管暢通后的缺血再灌注過程在臨床上往往會引起更大的損傷。很多因素在缺血再灌注腦損傷過程中起作用，例如谷氨酸的大量釋放、鈣離子超載、神經(jīng)元去極化、能量缺乏等等，其中一個重要的因素就是活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生[19]。腦缺血再灌注過程中，有很多途徑產(chǎn)生活性氧自由基，例如：線粒體的呼吸鏈、缺血再灌過程中激活的黃嘌呤／次黃嘌呤氧化酶、脂肪酸代謝，等等。由于腦組織高度的氧化磷酸化代謝率、高濃度的不飽和脂肪酸含量、相對低的抗氧化能力、神經(jīng)元的低修復(fù)能力和低分裂能力，腦組織對于氧化損傷十分敏感。短時間內(nèi)大量產(chǎn)生的活性氧會損傷細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂膜和DNA，抑制線粒體呼吸鏈，引起細胞能量供應(yīng)障礙，影響正常的細胞信號通路和基因轉(zhuǎn)錄。在大腦血液循環(huán)系統(tǒng)中，活性氧自由基的大量產(chǎn)生會損傷內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，引起血小板凝集和血管滲透性改變，導(dǎo)致腦水腫。

轉(zhuǎn)基因和基因敲除試驗表明，活性氧在缺血再灌腦損傷病程中起著作用[20]。因此,一些工作嘗試給動物服用酶或非酶的抗氧化劑，研究抗氧化劑對腦缺血再灌注損傷的保護作用。最新研究數(shù)據(jù)表明，用超氧化物歧化酶和過氧化物酶清除自由基，可以有效地減少腦缺血再灌注損傷。從植物中提取的天然抗氧化劑，如銀杏提取物EGB761和茶多酚，也被證明對缺血再灌注腦損傷具有顯著保護效果?？寡趸瘎┛梢酝ㄟ^清除活性氧自由基保護海馬CA1區(qū)神經(jīng)元免受缺血再灌注損傷，暗示抗氧化劑可以通過腦血屏障到達腦組織，起到保護作用。

有數(shù)據(jù)表明，一氧化氮在腦缺血再灌注損傷過程中起重要作用。一氧化氮能夠和超氧陰離子自由基反應(yīng)生成過氧亞硝基，這一強氧化劑，可以干擾正常離子代謝，從而促進缺血再灌注時的氧化損傷。一氧化氮可以直接或間接通過衍生物，抑制線粒體的電子傳遞鏈，引起細胞能量危機和DNA損傷，導(dǎo)致DNA合成障礙和細胞死亡。一氧化氮能夠增強缺血后興奮性氨基酸——谷氨酸的釋放，促進缺血后腦損傷。一氧化氮的作用就像一柄雙刃劍，除了對細胞和機體的毒性作用外，部分證據(jù)顯示一氧化氮同時具有保護作用。一氧化氮是強血管擴張因子、血小板凝集和白細胞粘附的抑制劑，通過抑制白細胞和血小板對毛細血管的阻塞，可以提高缺血再灌后腦組織的血液供應(yīng)，發(fā)揮保護作用。

2 天然抗氧化劑對老年退行性疾病的防治作用

體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除應(yīng)當(dāng)是平衡的，或者說體內(nèi)氧化和還原應(yīng)當(dāng)是平衡的，人體才能保持健康。這與中醫(yī)的陰和陽可能有類似的含義。如果自由基產(chǎn)生過多和清除自由基能力下降，體內(nèi)就會有多余的自由基，特別是氧自由基，會損傷細胞成分，但還沒有出現(xiàn)疾病的癥狀。如果不加以調(diào)整，繼續(xù)發(fā)展下去就會導(dǎo)致疾病和衰老的發(fā)生。這時需要從體外補充抗氧化劑，幫助達到體內(nèi)自由基的平衡，就可以預(yù)防疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，天然抗氧化劑（如茶多酚），對腫瘤有明顯預(yù)防和抑制作用，且對PD有明顯預(yù)防和防治作用；銀杏黃酮對心腦血管病有明顯預(yù)防和治療作用；大豆異黃酮和尼古丁對AD有預(yù)防作用；山楂黃酮對中風(fēng)有明顯預(yù)防和治療作用[1,2,3]。

2.1 茶多酚對腦神經(jīng)的保護作用

PD的治療，目前主要采用藥物、手術(shù)和基因治療等方法，但效果都不是很理想，一些藥物和方法副作用嚴(yán)重。因此，通過抗氧化劑等維持細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、抑制細胞凋亡，從而減緩或阻止神經(jīng)元的降解可以是一個重要的途徑。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑對神經(jīng)有明顯保護作用，例如天然抗氧化劑銀杏提取物，對許多環(huán)境因素引起的神經(jīng)元凋亡有較強的保護作用[22]。茶葉在中國和世界已有幾千年栽種和飲用歷史。喝茶有助于健康已被大眾廣泛接受，喝茶可以預(yù)防一些疾病也被流行病學(xué)研究所證實。研究表明，茶葉中對身體健康最有益的物質(zhì)是具有很強抗氧化能力的茶多酚。茶多酚在體內(nèi)外的許多氧化損傷體系中，也都有抑制凋亡信號、阻止神經(jīng)細胞凋亡發(fā)生、減緩或保護神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的功能[23～33]。在細胞水平上，我們應(yīng)用MTT、熒光顯微鏡、流式細胞分析和DNA電泳等技術(shù)和方法，研究了茶多酚及其單體化合物對6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的神經(jīng)保護作用。通過對6-OHDA單獨處理的和茶多酚提前處理過、而后用6-OHDA處理的PC12細胞形態(tài)及生理功能狀態(tài)變化的研究，我們發(fā)現(xiàn)茶多酚和其主要成分EGCG（(-)-epigallocatechin-3-gallate）和 ECG（(-)-epiocatechin-3-gallate），在 100～200 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)出明確的防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用，其它單體化合物沒有表現(xiàn)這種保護作用[23,24]。

應(yīng)用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)PD病理細胞模型，我們評價了茶多酚的神經(jīng)保護作用。實驗中我們選擇了6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞作為細胞模型，結(jié)果表明，茶多酚預(yù)處理可明顯改變凋亡細胞核變化，減少6-OHDA誘導(dǎo)的早期凋亡率，防止線粒體膜電位下降，降低細胞內(nèi)活性氧和鈣離子累積。茶多酚還可以抑制6-OHDA誘導(dǎo)NO含量升高和nNOS（neuron nitric oxide synthase）與iNOS（induced nitric oxide synthase)過量表達，降低細胞內(nèi)蛋白結(jié)合硝基酪氨酸水平。此外，茶多酚對6-OHDA自氧化有濃度-時間依賴性抑制作用。通過研究我們認(rèn)為茶多酚可能是通過活性氧-一氧化氮途徑，減少過氧亞硝基的生成，從而對6-OHDA誘導(dǎo)的細胞凋亡表現(xiàn)保護作用的[31]。

我們利用6-OHDA建立半PD大鼠模型，探討茶多酚對其保護作用的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA誘導(dǎo)動物旋轉(zhuǎn)行為是時間依賴性的，茶多酚可以濃度和時間依賴性地減輕6-OHDA誘導(dǎo)產(chǎn)生的旋轉(zhuǎn)行為，降低中腦和紋狀體中ROS和NO含量、抗氧化水平、脂質(zhì)過氧化程度、硝酸鹽/亞硝酸鹽含量、蛋白結(jié)合硝基酪氨酸濃度，同時降低nNOS和iNOS表達水平。TH免疫染色和TUNEL染色表明，茶多酚預(yù)處理可增加黑質(zhì)致密部存活神經(jīng)元，減少細胞凋亡。實驗結(jié)果證明，口服茶多酚可以有效保護腦組織免于6-OHDA損傷引起的神經(jīng)細胞死亡，其保護作用可能是通過ROS和NO的途徑實現(xiàn)的[33]。該工作發(fā)表在Biological Psychiatry雜志上，題目是《Protective effects of green tea polyphenols in the 6-OHDA rat model of Parkinson's disease through inhibition of ROS-NO pathway》，該雜志為此文章發(fā)布了一個新聞，該文還被Nature的網(wǎng)上雜志《自然中國》選為來自中國大陸和香港的突出科學(xué)研究成果。

作為茶葉主要成分的茶多酚，對氧自由基的清除作用是很強的，我們在這方面作過比較系統(tǒng)的研究[34～49]。我們得出的結(jié)論是，茶多酚的抗氧化作用在飲茶的健康益處和保護神經(jīng)防止帕金森病損傷作用中起著重要作用。目前這個項目正在北京宣武醫(yī)院進行臨床實驗，如果取得成功，將為廣大患者和老年人帶來福音。當(dāng)然，茶多酚是否可以有效防治神經(jīng)退行性疾病等尚需大量流行病學(xué)資料進一步證實。茶多酚是從綠茶中提取的多酚類化合物，盡管毒性實驗表明在很高劑量下才有毒性，但凡事總應(yīng)有個“度”，任何好東西，過分就會有負(fù)面效應(yīng)。希望每個人根據(jù)自己的實際情況飲茶，如果直接食用茶多酚，應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)生囑咐和說明書的用量。

2.2 尼古丁預(yù)防和治療帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥

吸煙有害健康，可以引起肺癌和呼吸道損傷，以及心臟病，戒煙是世界趨勢。一般人都認(rèn)為尼古丁是吸煙中的主要毒性物質(zhì)，其實這是一個誤會。流行病學(xué)研究報告顯示，吸煙可以減低PD和AD的發(fā)病率，也有一些實驗和臨床結(jié)果顯示煙堿可以預(yù)防并治療PD和AD[50,51]，這引起了人們的廣泛重視。

我們用色譜研究，發(fā)現(xiàn)尼古丁對6-羥多巴胺自氧化有明顯的抑制作用[52]。我們采用ESR自旋捕集技術(shù)研究尼古丁的抗氧化作用，及其對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用[53]，發(fā)現(xiàn)尼古丁對Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥基自由基，以及光照核黃素產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有明顯清除作用。吸煙產(chǎn)生大量高活性的氮氧自由基，這些自由基容易引起脂質(zhì)過氧化，而尼古丁能清除煙氣中的這些自由基。這一結(jié)果顯示尼古丁是一個天然抗氧化劑。

Aβ片段和全長擁有細胞毒性，我們以分離的小鼠海馬細胞為模型，研究了尼古丁對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細胞的保護作用[54,55]。研究結(jié)果表明：尼古丁可以保護海馬神經(jīng)元抵抗β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的凋亡。尼古丁可以抑制Aβ1～40或Aβ25～35在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中誘導(dǎo)的凋亡，以及caspase活力的升高。膽堿能抑制劑美拉明可以部分抑制尼古丁對Aβ誘導(dǎo)的caspase-3激活以及活性氧積累。這些數(shù)據(jù)表明尼古丁的保護作用部分是通過煙堿型受體起作用的，這些結(jié)果還表明尼古丁在治療神經(jīng)退行性疾病方面，比如AD，可能是很有潛力的。

我們以轉(zhuǎn)基因鼠和神經(jīng)細胞為模型，找到一個參與尼古丁介導(dǎo)神經(jīng)保護作用的信號通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼古丁可以減少淀粉樣蛋白（Aβ)在APPV717I轉(zhuǎn)基因小鼠（AD的一種轉(zhuǎn)基因動物模型)海馬和皮層區(qū)的沉積。尼古丁可以通過抑制MAPK的激活抑制NF-κB和C-Myc的活化，結(jié)果導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS)和一氧化氮（NO)生成下調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)，尼古丁對這種轉(zhuǎn)基因鼠中凋亡和異常細胞周期活動有明顯的抑制作用。RNA干擾試驗表明，尼古丁介導(dǎo)的神經(jīng)信號通路過程受α7 nAChRs調(diào)控。這些數(shù)據(jù)或許會給我們以啟示，即發(fā)展選擇性的α7 nAChRs激動劑或針對信號通路MAPK研發(fā)特異的抑制劑來治療AD，或許是一個潛在的、有發(fā)展前途的方向[55]。

我們以大鼠的腦線粒體為模型，檢測了尼古丁影響PP+和Ca2+對PT孔道開放的情況，及細胞色素C泄漏的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁可以通過競爭呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的NADH結(jié)合位點來抑制PT孔道的開放，其可能機制在于尼古丁與NADH的競爭導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ上的電子流動被抑制，改變了復(fù)合物Ⅰ與PT孔道調(diào)節(jié)相關(guān)的一些特征，進而抑制了PT孔道的開放，減少了線粒體膨脹、細胞色素C泄漏、線粒體膜電位下降以及防止還原型巰基的減少，揭示了尼古丁在防治神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮著重要作用[56]。

不正常的β-淀粉樣蛋白和金屬離子，比如銅和鋅之間的反應(yīng)，與β-淀粉樣蛋白的沉積有很密切的關(guān)系。我們研究了尼古丁對金屬離子在APPv717I轉(zhuǎn)基因鼠的海馬和皮層的代謝平衡。實驗發(fā)現(xiàn)，尼古丁可以顯著降低銅離子和鋅離子在老年沉積斑和其周圍神經(jīng)細胞團中的含量。在海馬CA1區(qū)的一個亞區(qū)中也觀察到了銅離子和鋅離子的分布密度的減少。我們進一步用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人APP的SH-SY5Y細胞，研究了尼古丁介導(dǎo)的金屬代謝平衡的可能機理。尼古丁處理可以顯著降低細胞內(nèi)銅的含量，并且這個作用是不依賴于尼古丁乙酰膽堿受體的。這些結(jié)果表明尼古丁降低β-淀粉樣蛋白的毒性是部分通過調(diào)節(jié)金屬離子的代謝平衡來達到的[57]。

2.3 大豆異黃酮和尼古丁可以預(yù)防和治療老年癡呆癥。

流行病研究表明，雌激素替代療法可以減少婦女更年期綜合癥和老年癡呆癥的發(fā)病率，但是雌激素療法可以引起乳腺癌和心臟病[58]。大豆異黃酮是植物雌性激素，又是一個抗氧化劑，也有減少婦女更年期綜合癥的作用，對多種慢性疾病具有保護作用，如動脈硬化。據(jù)報道，在神經(jīng)系統(tǒng)中，染料木黃酮能抑制Aβ在大鼠腦突觸體誘導(dǎo)的活性氧過度生成。大豆異黃酮通過激活雌激素受體減少神經(jīng)細胞凋亡[59,60]。

我們以培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元為模型進行研究，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮可以保護海馬神經(jīng)元抵抗β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的凋亡。通過檢測細胞的活性、細胞核的形態(tài)、DNA的片段化，以及細胞內(nèi)自由鈣離子的濃度、活性氧 (ROS)的量和caspase-3的活性，我們發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮能抑制β淀粉樣肽段 (25～35)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細胞凋亡。在不同濃度時，大豆異黃酮的作用機制是不同的。在100 nmol時，大豆異黃酮主要是通過刺激雌性激素受體起作用；而在40 mmol時，大豆異黃酮主要是通過它的抗氧化性起作用。我們的研究結(jié)果表明，大豆異黃酮可通過多種機制抑制β淀粉樣肽段 (25～35)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細胞凋亡。我們以轉(zhuǎn)(Aβ)線蟲為模型，研究了大豆異黃酮對線蟲癱瘓行為的影響和對活性氧產(chǎn)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可以明顯減少Aβ引起的線蟲癱瘓行為，降低線蟲體內(nèi)的Aβ，并且減少活性氧的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明大豆異黃酮在治療神經(jīng)退行性疾病方面，比如AD，可能是很有潛力的[61,62]。

2.4 山楂黃酮可以預(yù)防和治療中風(fēng)

山楂是最古老的藥用植物之一，被多國的藥典收錄。山楂提取物一直被用于治療與心臟相關(guān)的疾病，例如：早期充血性心衰和心絞痛。藥理研究表明，山楂提取物能夠降低血清中膽固醇的水平，抑制血小板凝集。山楂提取物中的主要成分為類黃酮、原花青素和酚酸，其中槲皮素、山萘酚、異鼠李素為EGB761的主要成分。研究證明，山楂提取物在體外和體內(nèi)都具有抗氧化作用，它能清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫，抑制脂質(zhì)過氧化。體內(nèi)試驗表明，山楂提取物能夠提高體內(nèi)的α-生育酚（即維生素E）的濃度，抑制人低密度脂蛋白的氧化。臨床研究表明，山楂提取物的抗氧化活性可能是它心臟保護作用的機制[63～65]。

我們用蒙古沙鼠中風(fēng)模型研究了山楂提取物對缺血再灌注損傷的作用，研究發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮可以有效抑制腦缺血再灌注損傷。應(yīng)用蒙古沙鼠雙側(cè)頸動脈結(jié)扎引起的腦損傷中風(fēng)模型，結(jié)果表明，缺血再灌注過程中，腦組織中活性氧產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）水平升高，抗氧化能力下降，動物口服山楂提取物可以劑量依賴性地減少缺血再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量，提高腦勻漿中抗氧化劑的水平。同時，缺血再灌注過程中，腦組織中一氧化氮的終產(chǎn)物硝酸鹽／亞硝酸鹽的濃度升高，ESR檢測到的一氧化氮產(chǎn)量降低，而用山楂提取物喂食動物，降低了腦組織中硝酸鹽／亞硝酸鹽的水平，提高了生物可利用的一氧化氮濃度。山楂提取物對一氧化氮的升高作用，可能是通過清除可與一氧化氮反應(yīng)的超氧陰離子產(chǎn)生的。iNOS在缺血再灌腦損傷的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起重要作用，用Western Blotting和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑處理動物可以劑量依賴地降低TNF-α和NF-κB的水平，降低iNOS的mRNA水平，這可能是山楂提取物在缺血再灌注腦損傷后期對腦組織保護的重要機制。腦冰凍切片尼氏染色、TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling assay）和透射電子顯微鏡檢測表明，山楂提取物處理使動物缺血再灌腦損傷后海馬CA1區(qū)成活的大錐體神經(jīng)元數(shù)量增加，DNA損傷減少，對腦損傷有保護作用。本實驗結(jié)果證明，口服天然抗氧化劑可以提高腦中抗氧化水平，保護腦組織免于缺血再灌腦損傷引起的神經(jīng)細胞死亡，保護作用可能是通過ROS和一氧化氮的途徑實現(xiàn)的。

3 結(jié) 論

我們發(fā)現(xiàn)自由基在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機理中起著重要作用，天然抗氧化劑作為神經(jīng)保護劑，對神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療作用機理，為神經(jīng)退行性疾病的基礎(chǔ)理論研究和臨床實踐提供了新的思路和實驗依據(jù)。

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This work was supported by grants from The National Natural Science Foundation of China(110200101056)and 973 Foundation from Department of Science and technology of China(2006CB500706)

Free Radicals,Natural Antioxidants and Neurodegenerative Disease

ZHAO Baolu
State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Science,Beijing 100101，China

Mar 10,2010 Accepted：Apr 5,2010

ZHAO Bolu,Tel：+86(10)64888569,E-mail：zhaobl@ibp.ac.cn

The neurodegenerative diseases,Alzheimer's disease(AD),Parkinson's disease(PD)and stroke seriously affect the health and life quality,which are becoming a social problem.The pathogenesis of these diseasesisnot clear and thereisno effective method to cure them.The free radical mechanism for neurodegenerative diseases，prevention and curative mechanisms of natural antioxidants againstthese diseases are reviewed in this paper.Reactive oxygen species(ROS)and NO free radicals generated from oxidative stress play an important role in the pathogenesis of AD,PD and stroke.Natural antioxidant drugs not only can cure the disease but also can enhance immunological responses of the patient leading to better health.For example,green tea polyphenols(GTP)can prevent 6-OHDA-induced cell apoptosis,stabilize mitochondrial membrane potential,suppress accumulation of ROS and of intracellular free Ca2+,prevent the animalsagainst 6-OHDA induced PD symptoms.Experiment resultsalso show that soy genestien and nicotine are benifical for PD and AD and studies show that nicotine can inhibitcytochrome Crelease from mitochondria induced by 6-OHDA/MPP+;nicotine can protect neuron against apoptosis induced by β-amyloid peptide;nicotine can inhibit β-amyloid deposit in brain;nicotine inhibit cupper and zinc deposit in the brain and nicotine can prevent neurodegenerative diseases by inhibiting NF-κB,nitric oxide synthase expression and NO generation through nAChRs,MAPK and C-Myc pathway.It was also found thatCrataegusflavone protects neuron cells against ischemia/reperfusion brain damage inMongolian gerbils.These results provide new insight for explaining the mechanisms of pathology of neurodegenerative diseases and neuroprotective effects of natural antioxidants.

Free radicals； Naturalantioxidants； Neurodegenerative diseases; Parkinson's disease；Alzheimer's disease；Stroke

2010-03-10；接受日期：2010-04-05

國家自然科學(xué)基金項目 (29935080)，“973”項目(2006CB500700)

趙保路，電話：(010)64888569，E-mail：zhaobl@ibp.ac.cn

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