吳 靜，鄭 浩，江 瑛，蘇 文，侯金佟，張 華

（1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院超聲診斷科，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學病理生理學教研室，北京 100069）

非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是病理組織學改變與酒精性脂肪性肝炎相似，但無過量飲酒史的一種慢性疾?。?］。NASH作為隱源性肝硬化的重要病因，日益引起臨床的重視［2、3］。但NASH的發(fā)病機制至今并不完全清楚，NASH嚴重的肝細胞脂變和氣球樣變常成為局部缺血和缺氧的原因，而局部缺血和缺氧又進一步加重NASH肝細胞損傷，表明肝臟血流動力學的異?？赡艹蔀镹ASH病變進展的重要因素之一。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知作用最強的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，具有促進內(nèi)皮細胞增殖，增強多種血管生成因子的促血管生成效應(yīng)，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促使血管通透性增加的作用，局部缺血和缺氧是調(diào)節(jié)VEGF表達的主要因素之一［4，5］。因此VEGF可能與NASH的發(fā)病有關(guān)。本實驗利用高脂飲食復(fù)制大鼠非酒精性脂肪肝損傷模型，通過高分辨率小動物顯微超聲成像系統(tǒng)檢測門脈系統(tǒng)靜脈內(nèi)徑等血流動力學指標，通過分子生物學方法檢測肝臟VEGF mRNA和蛋白表達水平，旨在探討NASH大鼠肝臟血流動力學的變化和VEGF在NASH的表達及其作用，為今后防治NASH提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立及分組

清潔級SD雄性大鼠110～130g 20只，由首都醫(yī)科大學動物中心提供，動物合格證號SCXK-（軍）2007-004。隨機分為對照組（10只，普通飼料喂養(yǎng)）和模型組（10只，高脂飼料即普通飼料基礎(chǔ)上加10％豬油和2％膽固醇喂養(yǎng)），飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境內(nèi)16周。

1.2 超聲檢查

采用Visual Sonics Vevo 770型超高頻小動物彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率20～40MHz，測量肝臟大小、回聲強度、后方回聲衰減、肝緣圓鈍及肝內(nèi)血管顯示程度進行評分（1為正常，2為輕度改變，3為明顯改變），取均值；測量門靜脈、脾靜脈和肝靜脈內(nèi)徑及最大血流速度（V），選用門靜脈長軸切面，取最大值作為門靜脈內(nèi)徑（D）；計算門靜脈血流量應(yīng)用公式：

Q（ml/min）=π×（D/2）2×V×60。

1.3 血生化指標檢測

腹主動脈采血（隔夜禁食），肝素抗凝，常規(guī)制備血清。應(yīng)用Olympus AU640全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）。

1.4 組織病理學檢查

取肝臟組織行冷凍切片和石蠟切片，分別進行HE染色，油紅O染色和Masson染色，觀察肝臟脂肪變性、氣球樣變和纖維化等病理變化。

1.5 免疫組織化學染色

免疫組織化學SP法染色，按說明書（PV-6002二步法免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）規(guī)范進行。切片脫蠟至水化，置3％過氧化氫，室溫30min，微波修復(fù)抗原。滴加5％BSA封閉液，37℃，30min；滴加VEGF單克隆抗體（sc-7269，Santa Cruz公司）1∶100稀釋液，4℃過夜；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗（兔抗鼠IgG），37℃，10min；DAB避光顯色，鏡下控制顯色時間；蘇木精輕度復(fù)染。以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.6 蛋白印記

稱取100mg肝組織，加入裂解液勻漿，4℃，以12 000g，離心15min，取上清蛋白定量。取100μg蛋白上樣進行SDS/PAGE電泳，經(jīng)硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)移，以5％脫脂奶粉封閉，然后加入一抗（VEGF1∶600或GAPDH1∶5 000）4℃過夜。以辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育，利用化學發(fā)光法顯色，結(jié)果曝光于膠片上。應(yīng)用ImageJ軟件進行吸光度分析，以VEGF和GAPDH的比值表示各組蛋白表達水平。

1.7 實時定量RT-PCR

用Trizol提取肝臟組織總RNA，按Promega公司RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實時定量PCR儀（美國，ABI公司7300 System），按SYBR Green PCR Master Mix（美國ABI公司）試劑盒說明書，將大鼠肝臟cDNA同時行VEGF和18sRNA基因定量PCR。VEGF引物：正義鏈：5′-CGTCTACCAGCGCAGCTATTG-3′，反義鏈：5′-GCACACAGGACGGCTTGAA-3′，18 sRNA正義鏈：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，反義鏈：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。反應(yīng)擴增條件為0℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環(huán)。將檢測的臨界點設(shè)定在PCR擴增過程中熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct）作為模板初始濃度的間接指標，結(jié)果用18sRNA進行校正。Ct值越大，基因表達量就越小。用2—ΔΔCt法計算相對基因表達量。將所擴增的PCR產(chǎn)物同時進行溶解曲線分析和電泳以保證擴增產(chǎn)物的特異性。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 病理改變

肉眼觀察對照組肝臟色澤紅潤，邊緣銳利；模型組肝臟體積增大，邊緣變鈍，呈灰黃色，表面可見黃白色不規(guī)則斑塊沉積。光鏡下觀察對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組肝細胞排列紊亂，呈大小泡混合性脂肪變性，伴肝細胞氣球樣變性、并可見大量炎性細胞浸潤、碎片狀壞死和少量纖維組織增生（圖1，見彩插3）。

2.2 超聲表現(xiàn)

正常對照組圖像為肝實質(zhì)回聲均勻，肝內(nèi)管系組織顯示清晰；模型組肝臟增大，肝緣圓鈍，實質(zhì)回聲細密增強，后方組織明顯衰減，肝內(nèi)管系組織顯示不清。超聲評分與病理評分結(jié)果一致［6］。門靜脈內(nèi)徑增大，肝靜脈內(nèi)徑減小，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖2）。門靜脈流速和肝靜脈流速均下降，但無統(tǒng)計學意義。

2.3 血生化指標

與對照組比較，模型組周大鼠ALT、AST增高、TC、TG增高，差異具有顯著性（P＜0.05）（表1）。

圖2 大鼠肝臟超高頻超聲圖像及血流動力學變化Fig.2 The high frequency ultrosound images of the liver and hemodynamic changes in the rats

表1 各組大鼠血生化指標Tab.1 The serum biochemical parameters in the rats（±s）

表1 各組大鼠血生化指標Tab.1 The serum biochemical parameters in the rats（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；*P＜0.05，compared with the control group.

組別Groups血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT（U/L）天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST（U/L）總膽固醇TC（mmol/l）對照組Control 43.55±8.96 126.83±27.47 1.57±0.34模型組Model 194.21±83.91* 362.57±117.13*3.17±2.17*

2.4 VEGF的表達

免疫組織化學染色結(jié)果表明，對照組大鼠肝組織VEGF蛋白表達量極低，僅在中央靜脈周圍個別肝細胞和竇內(nèi)皮細胞表達VEGF。模型組肝組織VEGF蛋白表達明顯增加，呈彌漫分布，陽性細胞主要為肝細胞和竇內(nèi)皮細胞，輕度脂變的細胞比氣球樣變的細胞VEGF蛋白表達更為明顯。而增生的炎性細胞和星形細胞則低表達甚至不表達VEGF蛋白。VEGF蛋白的Western blotting結(jié)果表明：對照組和模型組均有VEGF蛋白的表達，與對照組相比，模型組大鼠肝組織VEGF的表達增強，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖3，圖3A、3B見彩插3）。

圖3 各組大鼠肝臟VEGF蛋白的表達Fig.3 Expression of hepatic VEGF protein of each rat group

實時定量PCR結(jié)果表明，NASH大鼠肝臟VEGF mRNA表達水平明顯增加。實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)曲線和溶解曲線結(jié)果表明，質(zhì)控良好，擴增物為單一產(chǎn)物。模型組大鼠VEGF mRNA的水平大約是是對照組的3倍，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠肝臟VEGF mRNA水平Fig.4 The levels of hepatic VEGF mRNA in the rat groups

3 討論

本實驗利用高脂復(fù)制大鼠NASH模型，與臨床高脂飲食所致的NASH有相似的外因。實驗結(jié)果表明：此時不僅出現(xiàn)高膽固醇血癥，血清ALT及AST也顯著增高。病理檢查表現(xiàn)為肝細胞氣球樣變性和重度脂肪變性、伴炎性細胞浸潤和肝細胞碎片狀壞死及纖維組織增生。表明病程已進展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。

血液流變異常和血流動力學的變化是脂肪肝病變發(fā)展的重要病因之一。研究證實肥胖、肝臟脂肪浸潤可導(dǎo)致肝靜脈血流頻譜發(fā)生變化［7］。我們的研究結(jié)果也表明超高頻多普勒超聲可以較敏感地檢測非酒精性脂肪性肝病大鼠不同時期門脈系統(tǒng)血流動力學變化［8］。本實驗超聲檢查結(jié)果：表現(xiàn)為不僅肝臟增大，肝臟回聲前方彌漫增強，后方組織嚴重衰減至顯示不清，與脂肪肝的病理結(jié)果相一致，而且門靜脈內(nèi)徑增大，肝靜脈內(nèi)徑減小，靜脈流速減低，表明NASH大鼠伴有肝臟血流動力學異常。此時一方面因脂代謝的異常導(dǎo)致血液黏度增加，影響肝臟的血流供應(yīng)，引起肝組織缺血、缺氧和局部酸血癥，導(dǎo)致肝實質(zhì)內(nèi)糖元減少，脂肪堆積［7］。另一方面NASH發(fā)生時，由于肝細胞脂變和氣球樣變引起的肝實質(zhì)順應(yīng)性下降，而且隨著肝細胞腫脹增大，壓迫肝竇及肝內(nèi)血管，血流阻力加大，影響肝臟充盈和血液循環(huán)，肝靜脈順應(yīng)性的降低導(dǎo)致肝靜脈狹窄，流速降低。遠端阻力的加大，使門靜脈血流速度減低，管徑增寬。肝竇與肝細胞間的交換障礙最終導(dǎo)致肝臟功能損害。

VEGF在肝源性疾病的研究表明［9-12］，在肝功能完全代償或部分代償時VEGF的表達增強，而肝功能失代償時表達明顯下降。急性肝炎，肝硬化和肝癌患者血清VEGF水平明顯升高；在四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷大鼠和肝大部切除后的ob/ob小鼠肝臟VEGF水平明顯增加，VEGF通過與受體結(jié)合刺激肝竇內(nèi)皮細胞增殖和星狀細胞活化，促進肝細胞再生及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但VEGF在非酒精性脂肪性肝炎的表達水平及其作用并不清楚。本實驗結(jié)果表明，模型組肝組織VEGF蛋白表達明顯增加，呈彌漫分布，陽性細胞主要是肝細胞，腺泡Ⅲ區(qū)的肝細胞和外周未完全空化的肝細胞VEGF蛋白表達更為明顯。這可能與VEGF系缺氧誘導(dǎo)因子，而此區(qū)營養(yǎng)狀態(tài)較門管區(qū)差，缺氧更為明顯，細胞處于應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。而實時熒光定量PCR結(jié)果表明，NASH大鼠肝臟VEGF轉(zhuǎn)錄水平增加。此時肝細胞VEGF表達增加，可能是一種適應(yīng)反應(yīng)，通過誘導(dǎo)VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達，促使肝竇內(nèi)皮細胞分裂、增加肝竇形成、誘導(dǎo)新生血管的形成，以改善肝細胞的供血供氧，最大限度地維持肝細胞功能，以迅速適應(yīng)脂質(zhì)底物的供給增加，減少血運障礙，降低細胞缺血缺氧程度，促使肝細胞再生，阻止病變進展，利于創(chuàng)傷修復(fù)。但由于VEGF誘導(dǎo)的新生血管的不成熟和其滲透作用，因此可能并不能完全糾正缺氧。而VEGF活性增加的同時也可致炎性滲出增多，星形細胞激活，可能增加纖維化的風險。因此對于VEGF在NASH發(fā)病機制中的作用尚需進一步研究，而這些更深入的研究將有助于今后更好的防治NASH。

［1］Jansen P L.Nonalcoholic steatohepatitis［J］.Neth J Med，2004，62（7）：217-224.

［2］Adams LA，Lymp JF，St Sauver J，et al.The natural history of nonalcoholic fatty liver disease：a population-based cohort study［J］.Gastroenterology 2005，129：113-121.

［3］Caldwell SH，Crespo DM.The spectrum expanded：cryptogenic cirrhosis and the natural history of non-alcoholic fatty liver disease［J］.J Hepatol，2004，40（4）：578-584.

［4］Senger DR，Galli SJ，Dvorak AM，et al.Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid［J］.Science 1983，219：983-985.

［5］Ho QT，Kuo CJ.Vascular endothelial growth factor：biology and therapeutic applications［J］.Int J Biochem Cell Biol.2007，39（7-8）：1349-1357

［6］吳靜，鄭浩，江瑛，等.大鼠非酒精性脂肪性肝病超聲與病理變化的相關(guān)性研究［J］.中國超聲醫(yī)學雜志，2008，24（8）：688-691.

［7］丁聲珍，張楚武.脂肪肝的聲像圖表現(xiàn)及其與糖及脂肪代謝的關(guān)系［J］.中國超聲醫(yī)學雜志，1992，8（1）：60-61.

［8］鄭浩，江瑛，余豪，等.非酒精性脂肪性肝病門脈系統(tǒng)血流動力學變化的實驗研究［J］.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2008，24（6）：855-857.

［9］Akiyoshi F，Sata M，Suzuki H，et al.Serum vascular endothelial growth factor levels in various liver diseases［J］.Dig Dis Sci，1998，43：41-45.

［10］Rosmorduc O，Wendum D，Corpechot C，et al.Hepatocellular hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in experimental biliary cirrhosis［J］.Am J Pathol，1999，155：1065-1073.

［11］Giatromanolaki A，Kotsiou S，Koukourakis MI，et al.Angiogenic factor expression in hepatic cirrhosis［J］.Mediators Inflamm.2007，2007：1-4.

［12］Xu H，Shi BM，Lu XF，et al.Vascular endothelial growth factor attenuates hepatic sinusoidal capillarization in thioacetamideinduced cirrhotic rats［J］.World J Gastroenterol 2008，14（15）：2349-2357.