張小霞， 曹素梅， 梁振普， 喬冠華， 許 鋒， 陳曉慧

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002）

當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蟲(chóng)害是造成農(nóng)作物重大產(chǎn)量損失的主要原因之一，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展。傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲(chóng)方法對(duì)農(nóng)業(yè)的豐產(chǎn)增收起到了至關(guān)重要的推動(dòng)作用，但是隨著時(shí)間的推移，化學(xué)殺蟲(chóng)劑的弊端逐漸暴露出來(lái)?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑的使用不僅增加農(nóng)業(yè)成本，還會(huì)造成農(nóng)藥殘留、害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、殺滅天敵等破壞自然生態(tài)平衡的嚴(yán)重問(wèn)題。于是，生物防治方法日漸受到植保工作者越來(lái)越多的關(guān)注。特別是自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著植物基因工程的迅速崛起，有關(guān)人員把目光投向了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物方向。目前，已有多種抗蟲(chóng)基因被轉(zhuǎn)入植物中，并取得了良好的抗蟲(chóng)效果，尤其是轉(zhuǎn)基因Bt棉，有效控制了鱗翅目、鞘翅目等害蟲(chóng)，減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用量和次數(shù)，目前已大面積推廣與應(yīng)用。

刺吸式害蟲(chóng)因其獨(dú)特的取食特點(diǎn)給防治帶來(lái)了很大難度，它不僅會(huì)造成植物營(yíng)養(yǎng)成分的流失，還是植物病毒傳播媒介，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。鑒于轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲(chóng)有效成分屬于內(nèi)源性表達(dá)的物質(zhì)，因此此類(lèi)殺蟲(chóng)方法在刺吸式害蟲(chóng)的防治方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。

有報(bào)道稱，不同來(lái)源的植物凝集素對(duì)同翅目、鞘翅目等害蟲(chóng)有毒殺活性。當(dāng)植物受到傷害時(shí)，植物凝集素就會(huì)特異結(jié)合到昆蟲(chóng)消化道上，影響昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)，進(jìn)而有殺蟲(chóng)作用，因此可以用來(lái)進(jìn)行抗刺吸式害蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因研究及應(yīng)用。但有些植物凝集素對(duì)哺乳動(dòng)物也有顯著毒性，不適合用于轉(zhuǎn)基因工程。這就需要在研究過(guò)程中，通過(guò)分子生物學(xué)手段，篩選并改良出高效、安全的抗蟲(chóng)凝集素基因，以滿足刺吸式害蟲(chóng)防治的需求。針對(duì)目前的研究進(jìn)展和研究熱點(diǎn)，本文就植物凝集素基因的特點(diǎn)及其在抗刺吸式害蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用做較為詳細(xì)的闡述。

1 植物凝集素及其作用方式

自從1888年Stillmark首次在蓖麻種子中分離純化到一種植物凝集素—伴刀豆球蛋白Concanavalin A（ConA）以來(lái)，人們已經(jīng)分離純化了上百種植物凝集素。隨著對(duì)它們的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，植物凝集素的定義也處于修正狀態(tài)中。目前一般認(rèn)為，植物凝集素指含有一個(gè)或多個(gè)可與單糖或寡聚糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域的植物蛋白［1］。凝集素在自然界中分布非常廣泛且在植物體內(nèi)含量非常豐富，它在植物不同發(fā)育階段，以不同的方式保護(hù)著植物免受病蟲(chóng)害的侵害，是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分。植物凝集素作為植物的防御蛋白，其確切的作用機(jī)制目前還不十分清楚。一般認(rèn)為，當(dāng)凝集素被昆蟲(chóng)吞食至消化道時(shí)，可能有以下幾種作用方式：一是結(jié)合到圍食膜的幾丁質(zhì)上；二是結(jié)合到消化道上皮細(xì)胞暴露的糖絡(luò)合物；三是結(jié)合到糖基化的消化酶上。這些結(jié)合影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)還可能在消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，引發(fā)細(xì)菌、真菌及病毒的感染，抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，使害蟲(chóng)得病甚至死亡［2－4］。

采用cDNA克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)分離獲得了一些凝集素的基因及其轉(zhuǎn)基因植物，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲(chóng)性進(jìn)行了研究。目前成功運(yùn)用到植物抗蟲(chóng)基因工程中的凝集素有：雪蓮凝集素（Galanthusnivalisagglutinin，GNA）、半夏凝集素（Pinelliaternataagglutinin，PTA）、麥胚凝集素（Wheat gerMagglutinin，WGA）、莧菜凝集素（Amaranthuscaudatusagglutinin，ACA）、豌豆凝集素（P－lectin）等。

2 常見(jiàn)植物凝集素的特點(diǎn)與應(yīng)用

2.1 雪蓮凝集素

雪蓮凝集素是從石蒜科（Amaryllidaceae）雪花蓮中提取出來(lái)的一種植物凝集素。GNA分子是每個(gè)亞基為12.5ku的四聚體蛋白，每個(gè)凝集素單體有3個(gè)相同的結(jié)合甘露糖的位點(diǎn)。4個(gè)GNA單體構(gòu)成一個(gè)具有幾個(gè)充分暴露的結(jié)合甘露糖位點(diǎn)的蛋白，因此它是一種專一識(shí)別甘露糖的蛋白質(zhì)。GNA具有運(yùn)輸昆蟲(chóng)神經(jīng)肽的功能，發(fā)揮該功能的片段由105個(gè)氨基酸殘基組成，包括3個(gè)重復(fù)的約25個(gè)氨基酸殘基的同源片段，可以用來(lái)作為標(biāo)記以研究昆蟲(chóng)嗅覺(jué)通訊［5］。GNA對(duì)昆蟲(chóng)的作用部位經(jīng)研究認(rèn)為主要是在中腸的表皮細(xì)胞。通過(guò)免疫定位研究發(fā)現(xiàn)，GNA在褐飛虱體內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)是在中腸的碳水化合物域。另外，在褐飛虱的脂肪體、卵巢管以及整個(gè)血淋巴中均發(fā)現(xiàn)有GNA的存在，說(shuō)明GNA可以借助其甘露糖結(jié)合特性，穿透中腸壁進(jìn)入到昆蟲(chóng)的循環(huán)系統(tǒng)，引起系統(tǒng)中毒反應(yīng)［6－7］。

由于GNA對(duì)葉蟬、煙草夜蛾、蚜蟲(chóng)等咀嚼式和刺吸式昆蟲(chóng)具有普遍的抑制作用且對(duì)高等動(dòng)物的毒性較小，因此GNA比較適合于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因研究。目前，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功轉(zhuǎn)入GNA基因的植物有許多種，例如：煙草、水稻、小麥、葡萄、油菜等，這些植物均表現(xiàn)出了良好的抗蟲(chóng)效應(yīng)［8］。周巖等［9］報(bào)道轉(zhuǎn)GNA基因煙草能夠抑制桃蚜（Myzuspersicae）45%～60%的蟲(chóng)口密度，有的高達(dá)90%以上。Hilder等［10］報(bào)道轉(zhuǎn)GNA煙草對(duì)桃蚜的平均抑制率為50%。王關(guān)林等［11］用GNA基因轉(zhuǎn)化菊花，得到的最高蚜口密度抑制率為84%，高于轉(zhuǎn)基因煙草。梁輝等［12］研究表明，轉(zhuǎn)GNA基因小麥對(duì)禾谷縊管蚜在接種當(dāng)代即表現(xiàn)出明顯的毒殺作用；對(duì)麥長(zhǎng)管蚜，則表現(xiàn)為使蟲(chóng)體發(fā)育減緩，并且若蚜成活率降低。這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)都說(shuō)明了GNA對(duì)害蟲(chóng)有明顯毒殺作用。但是，由于抑制率等數(shù)據(jù)是在試驗(yàn)條件下計(jì)算得到的，因此當(dāng)實(shí)際應(yīng)用到大田中時(shí)，受多種因素影響，這些數(shù)據(jù)可能還需要進(jìn)行修正。

值得注意的是，有研究者認(rèn)為GNA低水平表達(dá)不僅不會(huì)毒殺害蟲(chóng)，反而可能促進(jìn)害蟲(chóng)的生長(zhǎng)［13］。另外，作物大面積連片種植時(shí)，害蟲(chóng)可能趨向于食用鄰近的未轉(zhuǎn)基因作物而不食用轉(zhuǎn)基因作物，從而影響抗蟲(chóng)效果。GNA的抑蟲(chóng)率還受大田整體的蟲(chóng)口密度等影響。因此，GNA轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法及其田間應(yīng)用技術(shù)都需要深入研究。

2.2 天南星科植物凝集素

2.2.1 半夏凝集素（PTA）

天南星科半夏為我國(guó)特有的多年生草本藥用植物，其塊莖為多用途中草藥。PTA屬于單子葉植物中甘露糖凝集素家族，其單體分子量為12，065u。PTA由4個(gè)相同的亞基組成，據(jù)朱黎［14］的推測(cè)該凝集素為不含糖鏈的蛋白，對(duì)熱和酸堿均具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，可以特異地凝集兔、鼠的紅細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制效應(yīng)。另外，PTA具有抑制病毒侵染的作用，研究者認(rèn)為其作用機(jī)制是：PTA通過(guò)與病毒粒子外殼蛋白表面的糖鏈結(jié)合，把病毒粒子凝集在一塊，從而導(dǎo)致病毒粒子的侵染力下降。

最先是黃大昉等［15］發(fā)現(xiàn)掌葉半夏和半夏的總蛋白具有抗同翅目蚜蟲(chóng)的作用。他們用棉蚜和麥蚜進(jìn)行生測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，人工飼料中含活性蛋白時(shí)，兩種蚜蟲(chóng)的成活率明顯下降。隨后潘映紅等［16］的試驗(yàn)顯示，具有抗同翅目蚜蟲(chóng)作用的是半夏凝集素蛋白。經(jīng)試驗(yàn)處理后的蚜蟲(chóng)繁殖率明顯下降，所產(chǎn)若蚜死亡率明顯高于對(duì)照。姚劍虹用PTA的粗提液進(jìn)行生測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示其對(duì)棉蚜、桃蚜具有明顯的殺蟲(chóng)效果，殺蟲(chóng)能力與GNA相似，提出PTA可以作為一種抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)［17］。張紅宇等［18］首次將PTA基因?qū)胨局?，并?duì)其抗蟲(chóng)性及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。轉(zhuǎn)PTA基因水稻的純系對(duì)褐飛虱的存活率和發(fā)育進(jìn)度有明顯的抑制作用?？拙S文［19］把PTA和高賴氨酸蛋白基因?qū)氤?jí)水稻中，以期得到抗蟲(chóng)性和高賴氨酸表達(dá)的水稻植株。

PTA是一種有效的抗蟲(chóng)基因，對(duì)蚜蟲(chóng)的致死效應(yīng)和GNA相似。但也有文獻(xiàn)認(rèn)為，PTA對(duì)哺乳動(dòng)物有顯著毒性，不適合用來(lái)作為抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。因此，關(guān)于PTA的生物安全性還有待于做進(jìn)一步的研究。

2.2.2 天南星凝集素 （Arisaemaheterophyllumagglutinin，AHA）

天南星科植物天南星是一種中國(guó)藥用植物，從它體內(nèi)提取的天南星凝集素AHA和其他天南星科植物凝集素一樣，對(duì)刺吸式昆蟲(chóng)具有毒殺作用。根據(jù)趙秀云博士論文研究，AHA的cDNA全長(zhǎng)1 169bp，編碼一個(gè)258個(gè)氨基酸的蛋白。AHA也是甘露糖結(jié)合凝集素家族的一個(gè)成員，其上含有3個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，其中2個(gè)位點(diǎn)比較保守，第3個(gè)略有差異。對(duì)AHA的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，AHA由12條β折疊片組成，片層之間有轉(zhuǎn)角和卷曲連接形成一個(gè)牢固的結(jié)構(gòu)，與其他甘露糖結(jié)合凝集素的三維結(jié)構(gòu)高度相似［20］。

根據(jù)李潤(rùn)植等［21］的報(bào)道，天南星凝集素不僅對(duì)棉蚜有明顯致死活性，而且對(duì)其生殖發(fā)育有明顯抑制效應(yīng)，從而可能影響其種群的擴(kuò)展。毛雪等［22］對(duì)4種植物凝集素的抗蚜效應(yīng)進(jìn)行了研究，棉花凝集素（Gossypiumhirsutumagglutinin，GHA）和蓖麻凝集素（Ricinuscommunisagglutinin，RCA）在高濃度下（2.0g／L以上）才顯示明顯的抑制作用，GHA作用稍大于RCA。只有天南星凝集素（AHA）在較低濃度（1.0g／L）時(shí)，就表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，飼喂6d時(shí)，生存率即降低26%。趙秀云的研究也顯示：在轉(zhuǎn)化AHA基因的煙草上，蚜蟲(chóng)種群擴(kuò)展速度明顯比在非轉(zhuǎn)基因植株上慢。這些研究顯示出AHA是具有抗蟲(chóng)活性的蛋白，可以用于控制同翅目害蟲(chóng)，AHA基因是具有應(yīng)用前景的新抗蟲(chóng)基因。

2.2.3 海芋凝集素（Alocasiamacrorrhizalectin，AML）

海芋為天南星科多年生常綠草本植物，是著名的抗癌中草藥。海芋凝集素的cDNA全長(zhǎng)為1 124bp，包含270個(gè)氨基酸。前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，經(jīng)切割以后，成熟的AML有247個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為29.7ku。該蛋白無(wú)糖基化位點(diǎn)，等電點(diǎn)為5.75，穩(wěn)定性比較高。AML和天南星家族凝集素及相似蛋白具有很高的同源性，二級(jí)結(jié)構(gòu)有很多的無(wú)規(guī)則卷曲，彼此通過(guò)轉(zhuǎn)角和卷曲連接，構(gòu)成一個(gè)十分緊湊的結(jié)構(gòu)。AML也是識(shí)別甘露糖接合位點(diǎn)的一種蛋白質(zhì)，有3個(gè)甘露糖結(jié)合區(qū)［23］。

對(duì)AML抗蟲(chóng)性進(jìn)行研究的主要是潘科等人。他們最先用海芋凝集素粗品和純化后的凝集素研究了對(duì)豆蚜的抗生作用。研究認(rèn)為AML對(duì)豆蚜有忌避作用和較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性。對(duì)豆蚜的生殖和蜜露分泌也有一定影響。隨后又對(duì)幾種鱗翅目昆蟲(chóng)采用不同的喂食方法，研究得出AML的主要?dú)⑾x(chóng)方式是以胃毒為主。并且結(jié)合前面的研究認(rèn)為AML對(duì)同翅目害蟲(chóng)的毒殺作用比對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)強(qiáng)。因?yàn)槔美ハx(chóng)離體細(xì)胞進(jìn)行殺蟲(chóng)活性物質(zhì)篩選相較昆蟲(chóng)生物測(cè)定有一定的優(yōu)勢(shì)，所以他們研究了AML對(duì)4種不同的昆蟲(chóng)離體細(xì)胞的毒殺作用。用AML處理昆蟲(chóng)細(xì)胞24h就使大部分細(xì)胞破壞消失，說(shuō)明AML是一個(gè)較強(qiáng)的殺蟲(chóng)蛋白，可以作為一個(gè)新的抗蟲(chóng)基因，值得對(duì)其進(jìn)行多方面的研究［24－26］。但是，目前還未見(jiàn)利用基因工程手段把AML基因?qū)胫参镏校芯科鋵?duì)害蟲(chóng)影響的報(bào)道。

2.3 莧菜類(lèi)凝集素

莧菜類(lèi)凝集素是一個(gè)小的凝集素家族，目前發(fā)現(xiàn)的不超過(guò)10種。它們都是由2個(gè)同源亞基以頭—尾方式排列而形成的二體。亞基有2個(gè)同源的結(jié)構(gòu)域：N－和C－端結(jié)構(gòu)域。糖結(jié)合位點(diǎn)在N－和C－結(jié)構(gòu)域連接的表層凹穴中［27－28］。莧菜類(lèi)凝集素對(duì)2－乙酰氨基－2－脫氧－D－半乳糖具有特異性，且其氨基酸序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)與其他植物凝集素不同。各種不同來(lái)源的莧菜類(lèi)凝集素抗蟲(chóng)能力也不盡相同。

郭洪年等［29］研究了尾穗莧凝集素（Amaranthus caudatusagglutinin，ACA）在植物中的抗蟲(chóng)作用。用ACA轉(zhuǎn)化煙草，用桃蚜對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行接蟲(chóng)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，78%的參試煙草對(duì)桃蚜蚜口密度增長(zhǎng)的平均抑制率在75%以上，在抗性植株上觀察到有桃蚜若蟲(chóng)死亡的現(xiàn)象。周永剛等［30］從莧屬植物千穗谷中擴(kuò)增出莧菜凝集素（Amaranthushypochondriacusagglutinin，AHA）并通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了煙草。轉(zhuǎn)AHA煙草抗蟲(chóng)試驗(yàn)表明，含內(nèi)含子的AHA和不含內(nèi)含子的AHA煙草對(duì)蚜蟲(chóng)的平均抑制率分別達(dá)57.2%和48.8%。鄧智年等［31－32］從野莧菜中克隆了野莧菜凝集素（Amaranthusviridisagglutinin，AVA）片段。轉(zhuǎn)化白菜后，生測(cè)試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)AVA基因的白菜可以抑制桃蚜的群體發(fā)展，平均抑制率為55.8%。有內(nèi)含子和無(wú)內(nèi)含子的AVA轉(zhuǎn)化煙草，得到的轉(zhuǎn)基因煙草抗蚜率分別為60.81%和50.63%。Wu等［33］把 ACA 基因?qū)朊藁ㄖ校瑢?duì)棉蚜的抑制率達(dá)64.5%。

從以上研究可以看出，不同來(lái)源的莧菜類(lèi)凝集素抗蟲(chóng)效果不盡相同，這可能是由于各種莧菜類(lèi)凝集素氨基酸組成有差異，進(jìn)而在高級(jí)結(jié)構(gòu)上造成差異，從而影響其抗蟲(chóng)效果。另外用含有內(nèi)含子和不含內(nèi)含子的基因轉(zhuǎn)化植株，得到的抗蟲(chóng)率也不相同，包含了內(nèi)含子的植株比沒(méi)有內(nèi)含子的植株抗蟲(chóng)性能要稍微高一些。其原因可能是內(nèi)含子的存在優(yōu)化了目的基因的表達(dá)，利于mRNA的穩(wěn)定和加工，提高了目的蛋白的表達(dá)量，使得植株的抗蟲(chóng)性提高。但是其確切的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究，研究結(jié)果將有助于人們進(jìn)一步了解內(nèi)含子存在的意義，也有利于揭示凝集素的作用機(jī)理，具有一定的科學(xué)理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

3 轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)基因的研究

由于轉(zhuǎn)單價(jià)抗蟲(chóng)基因的植株在大田生產(chǎn)中存在一些潛在的問(wèn)題。例如：抗蟲(chóng)譜窄，抗蟲(chóng)效果不太理想，容易使昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性等。因此通過(guò)不同抗蟲(chóng)基因之間的互補(bǔ)作用，構(gòu)建轉(zhuǎn)雙價(jià)或多價(jià)抗蟲(chóng)基因的植物是研究者亟待解決的問(wèn)題。

目前，轉(zhuǎn)多價(jià)抗蟲(chóng)基因的研究少有報(bào)道，研究較多的是雙價(jià)轉(zhuǎn)基因植物。在農(nóng)作物中，轉(zhuǎn)入雙價(jià)抗蟲(chóng)基因研究最多的是煙草、棉花和水稻等。王志斌等［34］采用GNA成熟蛋白基因與人工合成的GFMcryIA構(gòu)建了雙價(jià)基因中間載體，轉(zhuǎn)化煙草并用棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明40%的轉(zhuǎn)基因煙草植株具有高抗性；抗蚜試驗(yàn)表明其有效降低了蚜蟲(chóng)繁殖率，抑制蚜口密度為30%～50%，且獲得了數(shù)株兼抗棉鈴蟲(chóng)及蚜蟲(chóng)的煙草植株。趙存友等人用改造的全長(zhǎng)雪蓮凝集素基因與合成的帶有分泌信號(hào)肽編碼序列的Bt基因構(gòu)建雙價(jià)植物表達(dá)載體。對(duì)轉(zhuǎn)化再生煙草的生測(cè)結(jié)果表明，利用這兩個(gè)改造過(guò)的抗蟲(chóng)基因可以獲得既抗蟲(chóng)又耐蚜的雙抗轉(zhuǎn)基因植物［35］。劉召華等［36］構(gòu)建了ACA和改造后的GNA的雙價(jià)植物表達(dá)載體。將ACA和GNA基因轉(zhuǎn)化到煙草中，平均抑蟲(chóng)率達(dá)83.9%，且試驗(yàn)顯示這兩個(gè)基因的抗蚜功能可以穩(wěn)定遺傳。

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的廣泛種植給人們帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，但害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)Bt單基因抗蟲(chóng)棉的抗性是Bt棉進(jìn)一步應(yīng)用的潛在限制。為解決這一問(wèn)題，1995年中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)中心率先構(gòu)建了雙價(jià)抗蟲(chóng)基因，并導(dǎo)入棉花。隨后，轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)棉的研究日新月異。王偉［37］等將P－lec基因和SKTI基因轉(zhuǎn)化陸地棉，抗蟲(chóng)測(cè)試表明，轉(zhuǎn)基因棉株對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的抗性。劉志等對(duì)轉(zhuǎn)Bt和GNA雙價(jià)基因抗蟲(chóng)棉的抗性進(jìn)行了生測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，植株在不同生長(zhǎng)期的主莖葉對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有很高的抗性，對(duì)棉蚜群體具有明顯的抑制效果［38］。呂凱等人對(duì)轉(zhuǎn)Bt＋CpTI雙價(jià)基因抗蟲(chóng)棉和單價(jià)Bt棉的抗蟲(chóng)性進(jìn)行了比較。生育前期雙價(jià)抗蟲(chóng)棉及其雜交F1代的抗蟲(chóng)性略弱，但差異不顯著，生育后期雙價(jià)抗蟲(chóng)棉及其雜交F1代的抗蟲(chóng)性顯著強(qiáng)于Bt基因棉［39］。

在國(guó)外，研究轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)基因的工作仍以Bt基因?yàn)橹鬟x基因。工作重點(diǎn)大多是對(duì)Bt基因進(jìn)行修飾或?qū)t基因的不同區(qū)段進(jìn)行重新組合進(jìn)而得到抗蟲(chóng)效果比較好的轉(zhuǎn)化植株。Anwaar［40］等把cry1Ab和cry1Ac基因組合起來(lái)，構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化印度香米370并檢測(cè)了其抗蟲(chóng)性。接蟲(chóng)5d后，轉(zhuǎn)化株的害蟲(chóng)死亡率達(dá)到了100%，非轉(zhuǎn)化株為42.5%。轉(zhuǎn)化株葉面積損害指數(shù)為4%～16%，非轉(zhuǎn)化株為82.5%，抗蟲(chóng)效果非常顯著。Samir［41］等把編碼Cry1Ba蛋白的Domains I和III與Cry1Ia蛋白的Domain II組合起來(lái)形成嵌合基因SN19，轉(zhuǎn)化到馬鈴薯中，獲得了既抗鞘翅目又抗鱗翅目害蟲(chóng)的轉(zhuǎn)化植株且抗蟲(chóng)效果顯著。Singh等把天然的cry1Ea和cry1Ca進(jìn)行組合，形成了編碼Cry1EC蛋白的基因?？瓜x(chóng)試驗(yàn)顯示，成功轉(zhuǎn)入Cry1EC基因的棉花和煙草對(duì)甜菜夜蛾各個(gè)蟲(chóng)齡的致死率均為100%［42］。除了上述轉(zhuǎn)化兩種不同Bt基因的研究外，還有把Bt基因和其他植物凝集素結(jié)合起來(lái)的研究報(bào)道。例如：Maqbool等把兩種Bt基因（cry1Ac和cry2A）和GNA組合起來(lái)轉(zhuǎn)化印迪卡水稻M7和印度香米370，生測(cè)試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)三價(jià)植株對(duì)稻縱卷葉螟和三化螟致死率100%，對(duì)褐飛虱致死率25%，抗蟲(chóng)效果非常明顯［43］。Luke等把Bt基因和蓖麻毒素B鏈（RB）結(jié)合起來(lái)形成BtRB融合蛋白，他們把該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)玉米和水稻，研究了其抗蟲(chóng)性和對(duì)昆蟲(chóng)遺傳的影響。轉(zhuǎn)化BtRB的玉米植株對(duì)二化螟的致死率為75%，表達(dá)BtRB的水稻對(duì)二化螟的致死率為60%～90%［44］。

無(wú)論是兩種植物凝集素組合還是兩種Bt基因組合或者是Bt基因和凝集素組合，其抗蟲(chóng)效果都比僅含一個(gè)基因的好，并且抗蟲(chóng)譜較寬，能延緩害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的時(shí)間。因此構(gòu)建多價(jià)或雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，使其產(chǎn)生抗蟲(chóng)性的同時(shí)又減緩害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的速度，不破壞生態(tài)平衡，是今后植物抗蟲(chóng)基因工程的一個(gè)主要研究方向。但是在實(shí)際的大田應(yīng)用中，同時(shí)種植轉(zhuǎn)單價(jià)和雙價(jià)抗蟲(chóng)基因的植物，有可能會(huì)掩蓋轉(zhuǎn)雙價(jià)植株延緩昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的優(yōu)勢(shì)。據(jù)Zhao的研究結(jié)果顯示，同時(shí)種植轉(zhuǎn)單價(jià)（如Cry1Ac或Cry1C）和轉(zhuǎn)雙價(jià)（如Cry1Ac和Cry1C）Bt棉時(shí)，雙價(jià)Bt棉上的小菜蛾存活率比單獨(dú)種植雙價(jià)Bt棉的存活率要高。因此，為了延緩害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，應(yīng)盡量避免混合種植轉(zhuǎn)單價(jià)和雙價(jià)抗蟲(chóng)棉［45］。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

刺吸式口器害蟲(chóng)種類(lèi)繁多，包括同翅目、半翅目、蚤目及部分雙翅目昆蟲(chóng)，形態(tài)和生理特征特殊，具有體形小、繁殖快、后代數(shù)量大等特點(diǎn)。有很多刺吸式昆蟲(chóng)是植物病毒傳播媒介，它們不僅嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，而且造成了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降。因此，培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)農(nóng)作物非常重要。

目前，植物凝集素的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)工程研究大多集中在對(duì)GNA的研究上。迄今為止GNA基因已成功轉(zhuǎn)入馬鈴薯、番茄、煙草等9種作物中，研究證明GNA對(duì)刺吸式口器昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)、褐飛虱等同翅目昆蟲(chóng)有特效，但其大田應(yīng)用時(shí)的抗蟲(chóng)效果不是很理想。另一方面，研究表明GNA在低濃度時(shí)對(duì)害蟲(chóng)反有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用［13］，所以要求轉(zhuǎn)GNA的植株具有相對(duì)較高的表達(dá)水平，才能有較好的抗蟲(chóng)效果。因此，關(guān)于該基因的高效表達(dá)、轉(zhuǎn)基因植株的應(yīng)用技術(shù)方面還有待于做深入的研究。

天南星科植物為我國(guó)特有的中草藥植物，從植物體內(nèi)提取的凝集素有很好的抗蟲(chóng)效果。PTA的殺蟲(chóng)活性和GNA相似，但是其生物安全性成為限制其進(jìn)一步研究應(yīng)用的主要因素。今后要加強(qiáng)其抗蟲(chóng)機(jī)理的研究，改造或者刪除對(duì)哺乳動(dòng)物有毒性的基因片段，只利用對(duì)害蟲(chóng)有毒殺活性的基因片段轉(zhuǎn)化植株，從而得到不存在生物安全隱患的抗蟲(chóng)新品種。由于內(nèi)含子的存在與否影響莧菜類(lèi)凝集素的抗蟲(chóng)效果，因而需要加強(qiáng)該類(lèi)凝集素內(nèi)含子作用機(jī)理的研究，進(jìn)一步闡明該類(lèi)凝集素的抗蟲(chóng)原理，以便為轉(zhuǎn)基因提供理論基礎(chǔ)。為了更好地推進(jìn)抗蟲(chóng)基因工程的開(kāi)展，在以后的研究應(yīng)用中，要更加注重篩選新型、高效的抗蟲(chóng)基因，并深入開(kāi)展其抗蟲(chóng)機(jī)理、安全評(píng)價(jià)、不同抗蟲(chóng)基因之間的協(xié)同互補(bǔ)作用等研究，通過(guò)分子生物學(xué)手段改良出安全、高效的雙價(jià)或多價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物。

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