唐興剛,李 雪,李盛強,郭世寧

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東 廣州510642)

中藥生產的原材料,因土壤、氣候等環(huán)境因素及采收加工的不同,實際使用時不能保證藥材質量的穩(wěn)定,經加工提取得到的中間體,每個批次在成分含量、成分組成及各成分比例方面都不能保持一致。因此對中藥原材料、中間體及成方制劑的質量控制在中藥的應用上占據著很主要的位置。中藥指紋圖譜借用了法醫(yī)學上指紋鑒定的概念,對中藥的化學信息以現代分析技術給予表征并加以描述,全面反映中藥內在化學成分的種類與數量,對判斷中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣,控制中藥原材料、中間體及成品的質量,減少批間差異,并最終控制成品的質量起到了極其重要的作用。

1 色譜指紋圖譜

1.1 薄層色譜(T LC)指紋圖譜 薄層色譜法(TLC)一開始以簡單快速的鑒別為起點,20世紀60年代以后很快取代了紙色譜技術,至今在中藥鑒別中其應用頻率仍然最高,近年來發(fā)展的T LC自動掃描儀,用固定波長對薄層的各個斑點作掃描的圖譜比目測的層析圖譜更為客觀準確,也具有更好的指紋鑒別意義。李彩君等[1]以高良姜素為對照品,建立了高良姜藥材的薄層色譜定性鑒別,發(fā)現高良姜素、山柰素等8個特征熒光斑點構成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄層色譜指紋圖譜。劉和平等[2]以柴胡正品北柴胡為基礎建立柴胡皂苷高效薄層熒光色譜指紋圖譜,并對同屬品種南柴胡、錐葉柴胡、多枝柴胡、三島柴胡、西藏柴胡等的指紋圖譜進行比較分析,發(fā)現北柴胡指紋圖譜由19個特征熒光條斑組成。熒光色譜圖像與輪廓掃描圖譜結合分析比較,可分為北柴胡指紋圖譜模式、錐葉柴胡模式及大葉柴胡模式。北柴胡、南柴胡、多枝柴胡、三島柴胡雖然總皂苷含量相互有別,但指紋圖譜彼此相似。

1.2 毛細管電泳(CE)和高效毛細管電泳(HPCE)指紋圖 在指紋圖譜研究中毛細管電泳(CE)是一種較新的方法,它是以高壓電場為驅動力,以毛細管為分離管道,依據樣品中各組分之間電泳速度或分配行為的差異而實現分離的液相分離技術。毛細管電泳用于檢測中藥指紋圖譜,其優(yōu)點在于:(1)柱效高。(2)分析速度快,進樣體積小(納升級)。(3)適于直接分析水溶液,可直接分析“臟”樣品。(4)大小分子可同時分析,毛細管極易清洗。(5)開發(fā)新方法較快,儀器維護簡單等。胡坤等[3]以槲皮素為內標,采用毛細管電泳法,對不同批次、不同品種和不同儲存時間羅漢果的毛細管電泳指紋圖譜進行了比較,建立了羅漢果的毛細管電泳指紋圖譜。

HPCE技術在中藥材鑒別中的應用是近幾年發(fā)展起來的,它具有高效、快速、分辨力強、重現性好的特點,在中藥質量標準制訂方面的優(yōu)勢越來越明顯。王鋼力等[4]對11種卷柏屬藥用植物進行了HPCE指紋圖譜研究,建立了18個樣品的毛細管電泳的指紋圖譜。結果顯示,各主要色譜峰均顯示黃酮特征,說明卷柏屬植物在黃酮類成分上既有共性,也存在差別,這種差別對于藥材品種的鑒別有著一定的意義。1.3 高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜 高效液相色譜法(HPLC)作為最常用的指紋圖譜研究方法,具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏高、分析速度快、應用范圍廣等特點。中藥樣品中含有的成分絕大多數可在高效液相色譜儀上進行分析檢測,方法成熟,是目前指紋圖譜研究應用最多的一項技術。付紹平等[5]利用反相高效液相色譜法分析了10個不同產地的北五味子樣品,建立了由26個指紋峰和19個共有峰組成的北五味子指紋圖譜,確定了5個主要的指紋峰,為科學評價及有效控制北五味子質量提供了新方法。所建立的指紋圖譜可以用來區(qū)別不同產地北五味子藥材的優(yōu)劣,為進一步控制北五味子的質量提供依據。黃月純等[6]以廣東新會產廣陳皮(茶枝柑)指紋圖譜為基礎建立共有模式,可鑒定市場陳皮是否為廣陳皮,為廣陳皮質量控制與鑒定提供了參考。費陳忠等[7]采用高效液相色譜法(HPLC)以內標物香蘭素、總峰面積以及峰面積最大的9個共有峰為評價指標,建立了新型抗球蟲中藥復方TF-103的指紋圖譜,并采用“中藥色譜圖分析和數據管理系統(tǒng)”軟件進行了相似度計算。結果表明,該法操作簡單,精密度和穩(wěn)定性良好,有助于該中藥復方的質量控制和譜效關系的研究。

1.4 氣相色譜指紋圖譜(GC)氣相色譜法(GC)主要用于分析氣體、揮發(fā)性和半揮發(fā)性液體以及能夠產生足夠蒸汽壓的固體,或者沸點在500℃以下,相對分子質量400以下的物質。在中藥質量控制中主要用于揮發(fā)油、極性較小的成分或衍生化后的可揮發(fā)性成分(如脂肪酸的酯)。GC的特點是靈敏度高、分離度好、分析速度快,定量分析的精密度優(yōu)于1%。梁倩等[8]采用水蒸氣蒸餾法提取了7個產地的丹參花揮發(fā)油,對揮發(fā)油的主要成分進行了GC分析。GC法分析對比7個產地丹參花揮發(fā)油的相似性,結果7批丹參花的揮發(fā)油相似度較高,可作為控制丹參花成分的方法之一。

1.5 高速逆流色譜技術(HSCCC)高速逆流色譜技術(HSCCC)是當前國際上較新型的液-液分配技術。該技術應用動態(tài)液-液分配原理,利用相對移動的互不混溶的兩相溶劑,在處于動態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的樣品組分離。它不使用固相載體作固定相,克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰型拖尾等缺點。近年來,國內已報道將高速逆流色譜技術應用于天然產物的分離、分析及建立指紋圖譜。如將高速逆流色譜和質譜(HSCCC-Ms)聯用,分析鑒定生物堿、木脂素及三菇類化合物等,均取得了滿意的結果。顧銘等人[9]利用HSCCC分離純化雪蓮、丹參并成功制訂了其中藥指紋圖譜,也很好的說明了HSCCC在指紋圖譜方面的應用。

1.6 色譜聯用技術

1.6.1 高效液相/質譜聯用(HPLC/MS)指紋圖譜液質聯用技術對被測化合物的確認有很高的可信度,具有靈敏度高、選擇性好、精密度高等優(yōu)點,而且HPLC/MS有易于操作和自動化的特點。目前此項技術已經成為制藥業(yè)、藥物分析與研制領域十分重要的分析方法。張尊建等[10]采用HPLC-UV-MS法對丹參藥材、丹參注射液中間體及丹參注射液進行指紋圖譜的研究,得到分離度較好的丹參藥材、中間體及注射液的 HPLC-UV及HPLC-MS指紋圖譜,為丹參藥材、中間體及注射液的質量控制提供全面、可靠的依據。劉訓紅等[11]用HPLC-MS聯用技術對不同產地太子參進行分析,測定其總離子流指紋圖譜,確定共有峰,并對部分色譜峰進行了初步歸屬。發(fā)現少數產地太子參HPLC-MS指紋圖譜差異顯著,可作為太子參內在質量評價的依據。

1.6.2 氣相色譜/質譜聯用(GC/MS)指紋圖譜氣相色譜作為進樣系統(tǒng),將待測樣品進行分離后直接導入質譜進行檢測,既滿足了質譜分析對樣品單一性的要求,還省去了樣品制備、轉移的繁瑣過程,不僅避免了樣品受污染,對于質譜進樣量還能有效控制。質譜作為檢測器,檢測的是離子質量,獲得化合物的質樸圖,解決了氣相色譜定性的局限性。王儒靜等[12]對靈芝建立GC-MS指紋圖譜,并對靈芝硅烷化衍生物進行質譜定性分析,運用模式識別對不同產地的不同品質的靈芝進行鑒別分類,為進一步開發(fā)、利用靈芝資源、探索靈芝品質鑒別提供了線索。

2 光譜指紋圖譜

2.1 紅外光譜(IR)指紋圖譜 近年來,用紅外指紋圖譜法鑒別中藥的研究較多,在中藥標準的構建中也發(fā)揮著相當重要的作用,尤其是這一技術作為中藥鑒別的輔助手段,發(fā)展較快。紅外光譜的優(yōu)點是"多快好省"、是一種綠色分析技術;缺點是這種方法不是"原始方法",很難作為標準方法,且需要大量代表性樣品進行化學分析建模。田進國等[13]測試了大量中藥的紅外光譜,初步建立起對植物藥、礦物藥進行鑒別的紅外光譜分析法。徐永群等[14]首次運用紅外指紋圖譜對18個產地的中藥材赤芍進行了藥用部分全組份的快速分析,為赤芍道地商品的鑒別及質量控制提供了可靠的依據。

2.2 紫外光譜(UV)指紋圖譜 紫外光譜能夠給出藥效物質基礎的結構信息,但所給出的信息是所有化學物質結構信息的加和,不具備指紋特征,但可作為中藥指紋圖譜研究的輔助方法。鄒華彬等[15]采用共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法對不同產地、不同采集年份的白芍樣品及相近植物赤芍、丹皮樣品進行了定量評價。該法可以對至少2個樣品進行定量評價,克服了多種中藥鑒別方法只能進行真?zhèn)舞b別、產地鑒別的局限性,為中藥質量的準確定量評價提供了一種新方法。刁云鵬等[16]通過研究得出了紫穗槐果實和葉的紫外光譜指紋圖譜能夠準確鑒別紫穗槐果實和葉及其混淆品的結論。

3 其他研究方法

3.1 核磁共振氫譜(HNMR)指紋圖譜 核磁共振氫譜(HNMR)是鑒定有機化合物結構的重要方法之一,可以獲得化合物中包括各類質子的化學位移、數量、偶合關系等多個結構信息。植物類中藥的特征性化學成分的含量是相對固定的,在規(guī)范的提取分離條件下,植物類中藥的HNMR圖譜與植物品種則存在著嚴格的對應關系,沒有混淆的可能性,圖譜中的信號強弱反映了混合物中各組分的相對含量,在對特征性提取物進一步分離得到單體后,通過結構鑒定和HNMR研究,可以對指紋圖譜中的各特征譜線進行歸屬。HNMR指紋圖譜以其良好的單一性、全面性、定量性、易辨性、明顯的特征性和良好的重現性,預示了其在中藥鑒定中的應用前景。陳波等[17]用1HNMR分析測定35種從福建、云南、廣州、江西等地采集及購買的不同種類的茶葉。檢測出包括多種氨基酸在內的20種物質。所得譜圖經主要成分分析,實現了不同種類的茶葉以及鐵觀音產地的區(qū)分,并且發(fā)現了引起區(qū)分的化學成分。3.2 X-射線衍射(XRD)指紋圖譜 中藥材的XRD圖譜是藥材中所含各種成分的衍射譜的疊加,從整體上反映一般成分和主要成分的分布概況,從而可能提供較全面的有鑒別意義的數據。20世紀80年代末,X線衍射法在我國開始用于中藥鑒定。目前,我國要求一類和二類中藥新藥要附有粉末X線衍射譜。吳云山等[18]應用粉末X線衍射Fourier圖譜鑒定法對5個白芍中藥材樣品進行了分析,獲得了白芍的標準X線衍射Fourier圖譜及特征標記峰值,顯示了X線衍射Fourier圖譜鑒定分析方法在中藥指紋圖譜建立的應用中同樣具有廣闊的應用前景。

3.3 DNA指紋圖譜 DNA分子遺傳標記技術具有快速、微量、特異性強的特點,且不受生長發(fā)育階段、供應部位、環(huán)境條件的影響,已在中藥鑒定學研究中展示了良好的應用前景,并保持了強勁的發(fā)展勢頭。羅聯忠[19]等收集了23株靈芝栽培菌種為材料,從DNA水平上探討不同產地的靈芝菌種的差異。最后得到了兩條進行擴增分析可以有效鑒別大部分栽培菌種,作為分子標記的隨機引物。

4 展望

中藥建立標準指紋圖譜必須立足于中藥的特色,即中藥的整體作用特點。這就決定了中藥指紋圖譜研究的復雜性。目前國際上已普遍認可中藥指紋圖譜作為中藥質量控制的標準。美國FDA、WHO都已規(guī)定如果草藥的活性成分不明,可以提供色譜指紋圖譜以證明產品質量。在歐共體藥品申請注冊表格中植物藥制品要求對原料、中間體及成品進行標準化控制,即要建立指紋圖譜。

目前中藥指紋圖譜的研究多集中于單味藥化學成分的研究,以后對于中藥中間體、成品藥的研究應該加強。尤其是注射用藥物,因其直接進入血液,其質量控制更為重要,應作為主要指紋圖譜研究方向。

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