陳素云，何秋山，董小巖，吳小兵，高基民1,

1 溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325035

2 中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所 病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100052

3 南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣州 510515

4 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究有限公司，北京 100176

TNFα (腫瘤壞死因子 α) 在許多疾病的病理生理過程中起著重要的介質(zhì)作用，拮抗 TNFα已經(jīng)成為治療自身免疫性疾病的新手段[1]?？扇苄?TNFR (Soluble TNF receptor，sTNFR) 是腫瘤壞死因子受體胞外區(qū)經(jīng)剪切脫落而成，分為sTNFRI與sTNFRII兩種。它們都能與TNFα結(jié)合而拮抗其活性[2]。現(xiàn)已上市用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物 Etanercept被認(rèn)為是一種高效的 TNFα拮抗劑，它是一種融合蛋白，是通過將sTNFRII基因編碼區(qū)與IgG的Fc基因編碼區(qū)融合并在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而成。借助于Fc的二聚化作用使其拮抗 TNFα的能力較相應(yīng)sTNFR II 單體提高了50~1000倍[3]。由于體內(nèi)成熟的TNFα主要以三聚體形式存在[4-5]，本研究欲借助脂聯(lián)素球部 (Globular domain of adiponectin，gAD)可形成同源三聚體[6]的特性，構(gòu)建一種可溶性腫瘤壞死因子受體II-脂聯(lián)素球部的融合基因，并在無血清懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，試圖獲得具有更高比活性和穩(wěn)定性的TNFα拮抗劑。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

pET24-gAD質(zhì)粒由南方醫(yī)科大學(xué)高基民教授課題組提供；pGluc-Basic質(zhì)粒購自 NEB 公司；Max Efficiency DH5αTM購自Invitrogen公司；pBluescript SK質(zhì)粒為病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pAAV2neo質(zhì)粒、BHK-21S細(xì)胞由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所提供，BHK-21S細(xì)胞已經(jīng)過無血清懸浮馴化，在有血清存在時表現(xiàn)為貼壁生長，在化學(xué)成分限定的無血清培養(yǎng)基LK021中則表現(xiàn)為懸浮生長特性；L929細(xì)胞購自美國ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和材料

限制性內(nèi)切酶及連接酶、蛋白Marker、Gaussia Luciferase Assay Kit購自NEB公司；質(zhì)粒大提試劑盒購自Qiagen公司；Ficoll試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；ConA購自Sigma；Trizol試劑盒，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；G418購自 Merck公司；噻唑藍(lán) (MTT)、二甲基亞砜 (DMSO) 購自Ameresco；放線菌素D購自Fluka；鼠抗人脂聯(lián)素單抗由本元正陽基因技術(shù)有限公司譚淑萍老師提供；鼠抗人TNFRII單抗購自Abcam公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體購自中山金橋；IRD800CW羊抗鼠的IgG購自LI-COR公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco；化學(xué)成分限定培養(yǎng)基LK021由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所提供；人 TNFα國家標(biāo)準(zhǔn)品 (3500 U/支) 由中國藥品生物制品檢定所提供；hTNFR-Fc陽性對照品由復(fù)旦張江生物醫(yī)藥公司提供；100 kDa超濾離心管購自Sartorius；人脂聯(lián)素定量ELISA試劑盒購自北京博蕾德生物科技有限公司。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1 人腫瘤壞死因子II型受體胞外區(qū)的擴(kuò)增

抽取10 mL健康人外周血于肝素抗凝管中，以PBS稀釋 1倍后用 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，將其于含有2 μg/mL ConA的1640全培中培養(yǎng)24 h，離心收集剌激后的細(xì)胞，按Trizol Kit操作說明提取總RNA，取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板PCR擴(kuò)增得到目的基因sTNFRII。目的基因上游引物：5′-ggggtacc atggcgcccgtcgccg tctggg-3′ (下劃線部分為Kpn I酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-gaagctt gtcgccagtgctcccttcagctg-3′ (下劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn))。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增得到目的基因sTNFRII大小為771 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，Kpn I、Hind III雙酶切后克隆入pBluescript SK載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αTM，挑取氨芐抗性克隆，酶切及測序鑒定，獲得pBluescript SK-sTNFRII。

1.3.2 脂聯(lián)素球部區(qū)域基因的擴(kuò)增

以pET24-gAD質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增得到gAD基因片段。上游引物：5′-gaagctt cctggagaaggtgcctat gtatac-3′ (下劃線部分為Hind III酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-ccggatcc tcagtggtggtggtggtggtgc-3′ (下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增得到目的基因gAD大小為423 bp。gAD PCR產(chǎn)物純化后以BamH I與Hind III雙酶切后克隆入 pBluescript SK-sTNFRII中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αTM，挑取氨芐抗性克隆酶切鑒定，獲得pBluescript SK-sTNFRII-gAD。

1.3.3 sTNFRII-gAD融合基因克隆入pAAV2neo載體

將 pBluescript SK-sTNFRII-gAD用 Kpn I及BamH I酶切，得到目的基因sTNFRII-gAD，克隆到以Kpn I和Bgl II雙酶切的pAAV2neo載體片段中(BamH I和 Bgl II是同尾酶)，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAAV2neo-sTNFRII-gAD，酶切鑒定。

1.3.4 對照質(zhì)粒pAAV2neo-Gluc-gAD的構(gòu)建

構(gòu)建分泌型報告基因Gluc與gAD基因的融合基因Gluc-gAD作為pAAV2neo-sTNFRII-gAD的對照質(zhì)粒。根據(jù)pGluc-basic序列設(shè)計引物。上游引物：5′-ttaggtacc

gtcaccaccggcccc-3′ (下劃線部分為 EcoR I酶切位點(diǎn)，已去除終止密碼子)，以 pGluc-Basic為模板PCR擴(kuò)增得到含Gluc的目的片段。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，Kpn I、EcoR I雙酶切后克隆到pAAV2neo載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αTM，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pAAV2neo-Gluc質(zhì)粒。

根據(jù)Adiponectin開放閱讀框序列設(shè)計引物。上游引物：5′-gcggaattc

ccagccaccatgggagtc-3′ (下劃線部分為Kpn I酶切位點(diǎn)，陰影部分為ATG起始密碼子)，下游引物：5′-taagaattc

cctggagaaggtgccta-3′ (下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-ggcggatcc tcagtt ggtgtcatggta-3′ (下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)，陰影部分為終止密碼子)，以構(gòu)建成功的 pAAV2neosTNFRII-gAD質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到含gAD的目的片段，gAD片段回收后經(jīng)EcoR I與BamH I酶切后克隆入以EcoR I與Bgl II酶切的pAAV2neo-Gluc質(zhì)粒中，酶切鑒定獲得pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒。

1.4 BHK-21S細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

BHK-21S細(xì)胞在含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中 (37℃，5% CO2) 貼壁生長。參考LipofectamineTM2000說明書，轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板中，待BHK-21S細(xì)胞密度達(dá)到 80%~90%時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)基改換為不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，取0.8 μg質(zhì)粒用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋混勻，2 μL LipofectamineTM2000同樣用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋，將上述2種液體放到同一EP管中混勻，室溫避光放置20 min后分別加入對應(yīng)的24孔板中，6~8 h后補(bǔ)加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中sTNFRII-gAD蛋白表達(dá)的檢測

1.5.1 免疫熒光檢測

pAAV2neo-sTNFRII-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞24 h后，免疫熒光檢測目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。24孔板中轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的細(xì)胞和陰性未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞，分別棄去上清，PBS洗滌3次，用200 μL冰預(yù)冷的甲醇固定20 min，棄去甲醇，分別加入1∶300 (用5%脫脂牛奶稀釋)的鼠抗人脂聯(lián)素抗體或 1∶500 (用 5%脫脂牛奶稀釋) 的鼠抗人TNFRII抗體各200 μL，37℃溫育1 h。PBS洗滌3次后，加入1：100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗200 μL，37℃避光溫育1 h。PBS洗滌3次，加0.01%的伊文斯蘭染色15 min，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5.2 分泌性熒光素酶的檢測

按照 Gaussia Luciferase Assay Kit說明書，pAAV2neo-Gluc-gAD、pAAV2neo-sTNFRII-gAD轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞24 h后，分別取20 μL 細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入 50 μL Gluc底物，混勻后，用發(fā)光檢測儀(ModulusTM Luminometer) 測定其相對光強(qiáng)度單位(Relative light unit，RLU)，光子收集時間為10 s。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及無血清懸浮培養(yǎng)

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 pAAV2neo-sTNFRII-gAD和 pAAV2neo-Gluc-gAD分別導(dǎo)入BHK-21S細(xì)胞。利用pAAV2neo質(zhì)粒上帶有neo抗性基因篩選將質(zhì)粒DNA穩(wěn)定整合入基因組的 BHK-21S細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后第 2天改加含G418的選擇性培養(yǎng)基 (G418濃度為800 μg/mL)，細(xì)胞長滿后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加壓篩選15 d，獲得抗性細(xì)胞株。

抗性細(xì)胞株BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，分別改換為無血清懸浮培養(yǎng)基LK021培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×106/mL，加入丁酸鈉使其終濃度為10 mmol/L，24 h后離心收集上清。

1.7 培養(yǎng)上清的超濾濃縮和ELISA檢測

將抗性細(xì)胞 BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD，BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24 h的上清分別經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用100 kDa超濾濃縮管離心將上清濃縮20倍。濃縮后上清用人脂聯(lián)素定量ELISA試劑盒檢測sTNFRII-gAD蛋白含量，該試劑盒的包被抗體及檢測抗體采用的是鼠抗人脂聯(lián)素單克隆抗體，標(biāo)記檢測系統(tǒng)為生物素、親和素辣根酶，定量標(biāo)準(zhǔn)品為人全長脂聯(lián)素。

1.8 Western blotting檢測sTNFRII-gAD蛋白的表達(dá)

取濃縮20倍的上清10 μL加入10 μL 2×loading buffer，100℃沸水煮5 min，20 μL樣品上樣，10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后用濕膠轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。取出NC膜，用封閉液 (5%脫脂牛奶，PBS配制) 37℃封閉NC膜1 h。棄去封閉液，加入1：300 (用含5%脫脂奶的PBST稀釋) 的鼠抗人脂聯(lián)素單抗或 1：500 (用含 5%脫脂奶的PBST稀釋) 的鼠抗人TNFRII的單抗，溫育1 h。PBST洗滌NC膜3次后，加入1：5000 ( 用含5%脫脂奶的PBST稀釋) IRD800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃避光溫育1 h。避光PBST洗滌3次后，PBS洗滌2次去除多余的吐溫，用Odyssey紅外熒光成像儀進(jìn)行檢測。

1.9 sTNFRII-gAD融合蛋白的生物活性測定

以L929為靶細(xì)胞，檢測sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα殺傷細(xì)胞的中和活性[7]。取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，胰蛋白酶消化計數(shù)，用5%的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×105/mL，取96孔板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第2天將BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng) 24 h后收獲的上清以及 sTNFRII-Fc對照品(起始濃度為50 μg/mL) 分別用含20 μg/mL放線菌素D、20 U/mL TNFα的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行4倍比梯度稀釋，共稀釋10個梯度；棄去96孔板中L929細(xì)胞的上清，加入前面已倍比稀釋好的 sTNFRII-gAD融合蛋白上清樣品和 Gluc-gAD 上清樣品及sTNFRII-Fc對照品，每孔100 μL，每個梯度設(shè)3個復(fù)孔；同時加入含20 μg/mL放線菌素D與20 U/mL TNFα的DMEM培養(yǎng)液 (兩者結(jié)合殺傷性最大) 作為陰性對照。該96孔板在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液 (5 mg/mL) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，DMSO終止培養(yǎng)，檢測各孔的OD570值。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

重組質(zhì)粒pAAV2neo-sTNFRII-gAD和對照質(zhì)粒pAAV2neo-Gluc-gAD結(jié)構(gòu)如圖 1所示。其中包括CMV啟動子、sTNFRII基因、gAD基因和其后的6His序列、牛生長激素的 polyA加尾信號、AAV2的倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列 (ITR) 以及 Gluc-gAD基因。載體骨架上有新霉素抗性的 neo基因，便于轉(zhuǎn)染后的G418加壓篩選。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

pAAV2neo-sTNFRII-gAD用插入位點(diǎn) Kpn I和EcoR I雙酶切得到約7 kb載體片段和大于1 kb的sTNFRII-gAD片段 (圖2A)，與預(yù)期結(jié)果一致；用pAAV2neo克隆位點(diǎn)兩端的通用引物測序表明，sTNFRII-gAD 序列與預(yù)期序列相同；pAAV2neo-Gluc-gAD用Kpn I和EcoR I酶切可得到一條大于500 bp的片段，與Gluc 555 bp大小一致。用BamH I和EcoR I酶切可切出gAD與BGH polyA約接近700 bp的片段，與預(yù)期一致。用Kpn I和 BamH I可切出大于1 kb的片段，與Gluc-gAD預(yù)期大小一致 (圖2B)。

2.3 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞的免疫熒光檢測

圖1 pAAV2neo-sTNFRII-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Diagrams of recombinant expression vectors pAAV2neosTNFRII-gAD and pAAV2neo-Gluc-gAD. (A) pAAV2neosTNFRII-gAD vector. (B) pAAV2neo-Gluc-gAD vector. ITR: AAV2 inverted terminal repeat; CMV: cytomegalovirus promoter; sTNFRII: soluble TNF receptor II; gAD: globular domain of adiponectin; Gluc: Gaussia luciferase; BGH: bovine growth hormone polyA signal.

重組質(zhì)粒pAAV2neo-sTNFRII-gAD轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞24 h后，分別用抗人脂聯(lián)素單抗和抗TNFRII單抗進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果均可觀察到BHK-21S細(xì)胞的胞漿中有很強(qiáng)綠色熒光 (圖 3A，3D)，提示融合蛋白sTNFRII-gAD在BHK-21S細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)；pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK-21S細(xì)胞后，用抗 TNFRII單抗檢測 (圖 3E) 無綠色熒光顯示，而用抗脂聯(lián)素單抗檢測 (圖 3B) 能夠看到圍繞細(xì)胞核周圍的綠色熒光；未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照細(xì)胞分別用抗人脂聯(lián)素單抗和抗 TNFRII單抗檢測(圖3C，3F) 均未觀察到綠色熒光。

圖2 pAAV2neo-sTNFRII-gAD和pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pAAV2neo-sTNFRII-gAD and pAAV2neo-Gluc-gAD by enzyme digestion. (A) 1: DNA marker BM 5000; 2: pAAV2neo-sTNFRII-gAD digested with Kpn I and EcoR I; 3: pAAV2neo-sTNFRII-gAD. (B) 1: DNA marker BM 2000; 2: pAAV2neo-Gluc-gAD; 3: pAAV2neo-Gluc-gAD digested with Kpn I and EcoR I; 4: pAAV2neo-Gluc-gAD digested with BamH I and EcoR I; 5: pAAV2neo-Gluc-gAD digested with Kpn I and BamH I.

圖3 免疫熒光檢測 sTNFRII-gAD及 Gluc-gAD在BHK-21S細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 3 Detection of sTNFRII-gAD and Gluc-gAD protein expressed in BHK-21S cells with immunofluorescence staining. (A) pAAV2neo-sTNFRII-gAD detected by monoclonal antibody against adiponectin. (B) pAAV2neo-Gluc-gAD detected by monoclonal antibody against adiponectin. (C) Negative control detected by monoclonal antibody against adiponectin. (D) pAAV2neo-sTNFRII-gAD detected by monoclonal antibody against TNFRII. (E) pAAV2neo-Gluc-gAD detected by monoclonal antibody against TNFRII. (F) Negative control detected by monoclonal antibody against TNFRII.

2.4 Gluc-gAD在上清中表達(dá)

pAAV2neo-Gluc-gAD質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 BHK-21S細(xì)胞24 h后，用Gaussia Luciferase檢測試劑盒及ModulusTM Luminometer發(fā)光檢測儀檢測上清中的Gluc活性 (圖4)，結(jié)果顯示Gluc蛋白在上清中有較高表達(dá)；而 pAAV2neo-sTNFRII-gAD轉(zhuǎn)染BHK-21S后的檢測數(shù)值與新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液所測數(shù)值基本相同。該實(shí)驗(yàn)表明Gluc-gAD融合蛋白可以有效表達(dá)并分泌到上清中。

2.5 無血清培養(yǎng)上清中sTNFRII-gAD、Gluc-gAD融合蛋白的分泌表達(dá)

圖4 pAAV2neo-Gluc-gAD和pAAV2neo-sTNFRII-gAD轉(zhuǎn)染BHK-21S細(xì)胞后上清中Gluc的檢測Fig. 4 Detection of Gluc protein in supernatant of BHK-21S cells transfected with pAAV2neo-Gluc-gAD or pAAV2neosTNFRII-gAD.

BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24 h后的上清經(jīng)100 kDa超濾管濃縮20倍后，ELISA檢測 sTNFRII-gAD蛋白含量相當(dāng)于0.28 μg/mL、SDS-PAGE電泳及免疫印跡分析還原狀態(tài)/非還原狀態(tài)的 sTNFRII-gAD融合蛋白樣品 (圖5)。 對于還原狀態(tài)的樣品，用抗人脂聯(lián)素單抗檢測(圖 5B) 在約 62 kDa處有特異性條帶，比預(yù)期的sTNFRII-gAD蛋白分子量 43 kDa要大；而用抗TNFRII的單抗檢測 (圖5C) 則未見特異性條帶。對于非還原狀態(tài)的樣品，濃縮后上清除了在約62 kDa處與脂聯(lián)素單抗及TNFRII單抗 (分別為圖5D，5E)有特異性條帶外，在小于但接近175 kDa處和遠(yuǎn)大于175 kDa處也有特異性條帶，提示BHK-21S細(xì)胞表達(dá)分泌至上清中的sTNFRII-gAD蛋白除單體外，還有三聚體和三聚體以上的多聚體；還原樣品的SDS-PAGE用考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 (圖5A) 顯示在約62 kDa處有一條主帶，與相同樣品經(jīng)抗人脂聯(lián)素單抗免疫印跡分析的條帶位置一致 (圖 5B)，且SDS-PAGE中其他雜帶非常弱，提示 BHK-21S/ pAAV2neo-sTNFRII-gAD無血清懸浮培養(yǎng)的上清中主要成分是sTNFRII-gAD融合蛋白。

此外，BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng) 24 h后的上清經(jīng)100 kDa超濾管濃縮20倍(還原狀態(tài)) 后進(jìn)行Western blotting分析，用抗人脂聯(lián)素單抗檢測 (圖5F-12) 顯示在接近47.5 kDa處有特異性條帶，比陽性對照人血清樣品所含的脂聯(lián)素(約30 kDa的分子量，圖5F-13) 要大，表明Gluc-gAD融合蛋白也能分泌到培養(yǎng)基上清中。

圖5 SDS-PAGE及免疫印跡分析鑒定BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD和BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng)上清中sTNFRII-gAD融合蛋白和Gluc-gAD融合蛋白的表達(dá) (已濃縮20倍)Fig. 5 SDS-PAGE and Western blotting analysis of sTNFRII-gAD and Gluc-gAD fusion proteins in the supernatants of serum-free cultured BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD and BHK-21S/pAAV2neo-Gluc-gAD (20-fold concentration). 1,3,5,7,9,11: protein marker; 2: SDS-PAGE of sTNFRII-gAD fusion protein stained with Coomassie blue; 4,6: Western blotting of reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody either against adiponectin or against TNFRII; 8,10: Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody either against adiponectin or against TNFRII; 12: Western blotting of reduced Gluc-gAD fusion protein with monoclonal antibody against adiponectin; 13: adiponectin (positive control) in the serum with monoclonal antibody against adiponectin.

2.6 sTNFRII-gAD融合蛋白中和TNFα的生物活性

BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD和BHK-21S/ pAAV2neo-Gluc-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24 h后，收集上清，分別檢測它們對TNFα殺傷L929細(xì)胞的中和活性。sTNFRII-Fc融合蛋白 (濃度由50 μg/mL開始，4倍比梯度稀釋) 在本研究中作為拮抗TNFα的陽性對照。sTNFRII-Fc融合蛋白具有中和TNFα的活性，且其抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性呈劑量依賴性(圖6B)；同理，sTNFRII-gAD融合蛋白也能夠抑制TNFα對L929細(xì)胞的殺傷作用，并與sTNFRII-Fc融合蛋白有類似的梯度曲線 (圖 6A)。陰性對照Gluc-gAD融合蛋白無中和TNFα的作用，由此說明對TNFα的中和作用是sTNFRII-gAD融合蛋白所特有的。

圖6 上清中sTNFRII-gAD融合蛋白對TNFα中和活性的檢測Fig. 6 TNFα-neutralizing activity of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatant of BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD serum-free culture.

3 討論

TNFα是一種重要的生物活性因子，具有抗腫瘤、抗病毒、防止細(xì)菌對機(jī)體的侵害作用。然而，過多 TNFα的產(chǎn)生和釋放則會破壞機(jī)體的免疫平衡，導(dǎo)致自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生[8]。TNFα主要通過與細(xì)胞膜上的特異性受體(TNFR) 結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性，TNFR有TNFRI和TNFRII兩種，其胞外區(qū)域均可經(jīng)剪切脫落成為sTNFR。sTNFR不介導(dǎo)信號的傳導(dǎo)，但仍能與TNFα結(jié)合，中和TNFα的活性，是TNFα的天然拮抗劑[9]。商品化Etanercept即sTNFRII與IgG的Fc形成的融合蛋白，此融合蛋白不僅延長了受體在體內(nèi)的半衰期，并且借助于Fc的二聚化作用使融合蛋白形成同源二聚體，相比可溶性的sTNFRII單體更能有效地抑制TNFα的作用，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，能有效緩解疼痛，防止或明顯降低關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，從而改善并維持關(guān)節(jié)功能。研究表明，成熟的TNFα以三聚體形式存在。因此設(shè)想，若sTNFRII能形成同源三聚體，則可能獲得更高效的TNFα拮抗劑。

脂聯(lián)素是近年來發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白激素[10-13]，血漿中濃度為5~30 μg/mL。脂聯(lián)素全長由信號肽、一段特異的氨基酸序列、膠原狀區(qū)域和球狀結(jié)構(gòu)域4部分組成。gAD為脂聯(lián)素在蛋白酶裂解作用下產(chǎn)生，是全長脂聯(lián)素的羧基端部分。Fruebis等研究報道，gAD能夠增強(qiáng)肌肉組織中脂肪酸的氧化，其活性優(yōu)于全長脂聯(lián)素[14]；Shapiro等通過晶體結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素的球狀區(qū)域以緊密的同源三聚體形式存在，并且與膠原 8、膠原 9和補(bǔ)體C1q具有相似的結(jié)構(gòu)特征。全長脂聯(lián)素通過其球狀結(jié)構(gòu)可形成緊密的同源三聚體，繼而通過其膠原狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步形成更為復(fù)雜的同源多聚體，但gAD的三聚體是脂聯(lián)素的基本結(jié)構(gòu)形式。

本研究擬借 gAD能自發(fā)形成同源三聚體的特性，以實(shí)現(xiàn)sTNFRII的同源三聚體化，從而獲得一種TNFα新型拮抗劑——sTNFRII-gAD融合蛋白。

首先構(gòu)建了sTNFRII-gAD融合基因，同時還構(gòu)建了分泌型 Gluc-gAD融合基因作為對照。Gluc為Gaussia熒光素酶(Gaussia luciferase)，是海洋橈角類生物Gaussia princeps來源的蛋白，具有高分泌、易檢測等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的熒光素報告基因[15]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的sTNFRII-gAD和Gluc-gAD融合基因分別采用了 sTNFRII和 Gluc基因天然的信號肽。將pAAV2neo-sTNFRII-gAD和pAAV2neo-Gluc- gAD重組表達(dá)載體分別瞬時轉(zhuǎn)染 BHK-21S細(xì)胞，用抗TNFRII或抗gAD的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測分析：pAAV2neo-sTNFRII-gAD轉(zhuǎn)染細(xì)胞用上述兩種抗體均檢測到了陽性信號，而 pAAV2neo-GlucgAD轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅用抗gAD的單克隆抗體可檢測到綠色免疫熒光；在pAAV2neo-Gluc-gAD轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中可檢測到很高的 Gluc酶活性。這些結(jié)果表明sTNFRII-gAD融合蛋白和 Gluc-gAD融合蛋白在BHK-21S細(xì)胞中分別獲得了有效表達(dá)；且Gluc-gAD融合蛋白能有效地分泌到上清中。

在此基礎(chǔ)上，通過 G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)sTNFRII-gAD融合蛋白和Gluc-gAD融合蛋白的細(xì)胞株。采用的表達(dá)載體pAAV2neo與常用的真核表達(dá)載體如pcDNA3.1不同之處在于：pAAV2neo中攜帶了腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 來源的2個ITR序列，使得表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在加G418選擇培養(yǎng)時更容易形成穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

為了便于以后大量制備 sTNFRII-gAD融合蛋白，在獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株以后，將培養(yǎng)液由原來含10%胎牛血清的DMEM換成化學(xué)成分限定的無血清、無蛋白、無肽的培養(yǎng)液LK021 (北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司)。所采用的 BHK-21S細(xì)胞在更換培養(yǎng)液后細(xì)胞由原來的貼壁培養(yǎng)方式直接變成了懸浮培養(yǎng)方式，期間不需要再次馴化。收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)24 h后的上清并經(jīng)100 kDa膜包濃縮20倍后，SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色顯示只有一條主帶，與抗脂聯(lián)素單抗免疫印跡檢測到的特異性條帶位置相同，而其他位置的蛋白條帶染色很淺，提示無血清培養(yǎng)后的細(xì)胞分泌到上清中的sTNFRII-gAD融合蛋白較純，十分有利于以后的純化。

對BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD無血清懸浮培養(yǎng)24 h后的上清經(jīng)100 kDa膜包濃縮20倍后，進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，含有DTT的還原樣品用抗 TNFRII單抗未檢測的特異性蛋白條帶，而相應(yīng)的非還原樣品則有特異性蛋白條帶。這可能是由于采用的抗 TNFRII的單抗只能識別sTNFRII的空間表位 (而不是線性表位) 所致。用抗脂聯(lián)素的單抗進(jìn)行免疫印跡檢測，則無論是還原樣品還是非還原樣品均檢測到特異性蛋白條帶，說明所用的抗脂聯(lián)素單抗識別的是gAD線性表位。此外，用抗 TNFRII單抗和抗脂聯(lián)素單抗，在非還原的sTNFRII-gAD融合蛋白樣品中，除單體 (62 kDa) 的特異性蛋白條帶外，均可檢測到在接近175 kDa處和遠(yuǎn)大于175 kDa處有特異性蛋白條帶，提示所表達(dá)的sTNFRII-gAD融合蛋白以單體、三聚體和三聚體以上的多聚體形式存在。

為了驗(yàn)證 sTNFRII-gAD融合蛋白中起中和TNFα作用的只是N端的sTNFRII，在活性測定時以pAAV2neo-Gluc-gAD融合蛋白作為陰性對照，以sTNFRII-Fc融合蛋白作為陽性對照?；钚詼y定結(jié)果表明，sTNFRII-gAD融合蛋白具有中和TNFα的活性，并與sTNFRII-Fc融合蛋白有類似的梯度曲線，而陰性對照Gluc-gAD融合蛋白則無拮抗TNFα的活性。

本研究設(shè)計并構(gòu)建了一種 TNFα新型拮抗劑——sTNFRII-gAD融合蛋白，建立了無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21S細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在細(xì)胞上清中檢測到了sTNFRII-gAD融合蛋白的表達(dá)且該融合蛋白以單體、三聚體和三聚體以上的多聚體形式存在，并證實(shí)了上清中的 sTNFRIIgAD融合蛋白具有中和TNFα的活性。因此，本研究為下一步大量制備sTNFRII-gAD融合蛋白，以便進(jìn)一步研究該融合蛋白的單體、三聚體和三聚體以上多聚體及其相應(yīng)的生物功能打下了良好的基礎(chǔ)。

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