趙智明,郭 寒,焦東東,陸 樂,蔡 輝

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,南京 210002)

美托洛爾對(duì)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

趙智明,郭 寒,焦東東,陸 樂,蔡 輝

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,南京 210002)

目的探討美托洛爾對(duì)充血性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)雄性SD大鼠60只,隨機(jī)分為空白組(n=15),模型組(n=45)皮下注射異丙基腎上腺素2次(170 mg/kg),6周后應(yīng)用超聲心動(dòng)圖檢測(cè),以左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)小于或等于45%確定造模成功,將心力衰竭大鼠模型隨機(jī)分為對(duì)照組(n=13)、美托洛爾治療組(n=14)8 mg?kg-1?d-1,18周使用左心導(dǎo)管進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢查,并利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA斷片化和免疫印跡分析法檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3的表達(dá)。結(jié)果(1)與空白組相比,對(duì)照組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯惡化,心室質(zhì)量指數(shù)(VWI)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVWI)顯著升高,心肌細(xì)胞凋亡率增加;(2)與對(duì)照組比較,美托洛爾組心率(HR)、左心室舒張末壓力(LVEDP)、VWI及LVWI明顯降低(P＜0.05)和±dp/dtmax明顯升高(P＜0.05),左心室重量指數(shù)明顯降低(P＜0.05),心肌細(xì)胞凋亡率下降。結(jié)論

美托洛爾能抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能,逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。

美托洛爾;充血性心力衰竭;SD大鼠;異丙基腎上腺素;心肌細(xì)胞凋亡

充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)是各種心血管疾病的共同轉(zhuǎn)歸,嚴(yán)重威脅著人類的健康。在心力衰竭(心衰)發(fā)生過程中,心肌細(xì)胞凋亡可能起了重要作用。本研究以心衰大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察美托洛爾對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響,并探討其意義,從而為臨床防治心衰提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 9周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量230～280 g),購于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心。藥品:美托洛爾(AstraZeneca,批號(hào):0604045);鹽酸異丙基腎上腺素(ISO)購自美國SIGMA公司(批號(hào):I5627)。RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies,Grand Island,NY),New bovine serum(NBS,杭州四季青),dithiothreitol(DTT,Sigma),Mouse anti-Bcl-2 monoclonal antibody,mouse anti-Bax monoclonal antibody and anti--tubulin(購自 Santa Cruz Biotechnology公司);Cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 antibody購自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及分組 模型組45只,皮下注射ISO 0.25 mL(170 mg/kg,分2次,間隔24 h);正常組15只,皮下注射生理鹽水0.25 mL[1]。飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃,常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。于實(shí)驗(yàn)第6周應(yīng)用彩色超聲監(jiān)測(cè)儀(型號(hào):HPsonos 5500,探頭頻率7.5 MHz,產(chǎn)地:美國)測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(LEVF)。測(cè)定值為5個(gè)心動(dòng)周期的均值。以LVEF≤45%為造模成功(n=41)[2]。將造模成功大鼠隨機(jī)分為心衰對(duì)照組(NS 0.1 mL?kg-1?d-1灌胃,n=13)和美托洛爾組(metoprolol 8 mg?kg-1? d-1灌胃,n=14),飼養(yǎng) 18周,觀察大鼠的飲食、毛色、活動(dòng)、發(fā)紺、水腫等一般性狀,每周稱體質(zhì)量(BW)。

表1 2組大鼠血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果(±s)

表1 2組大鼠血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果(±s)

*:與正常組比較,P＜0.05;#:與心衰對(duì)照組比較,P＜0.05。

組別 n HR LVEDP LVSP dp/dtmax -dp/dtmax正常組 15 400.5±13.3 1.2±0.6 120.2±2.3 3.82±0.05 -3.61±0.02心衰對(duì)照組 13 453.3±10.8* 11.1±0.6* 104.8±1.7 2.33±0.05* -1.90±0.07*美托洛爾組 14 347.5±9.9*# 5.4±0.3*# 100.1±1.5 3.37±0.04*# -2.84±0.04*#

1.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 18周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,將大鼠以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后,應(yīng)用左心導(dǎo)管插入左心室,通過壓力換能器輸入BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),由實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件處理獲得左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)心率(HR)。

1.4 心臟質(zhì)量指數(shù)測(cè)量 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完畢后迅速打開胸腔摘取心臟,肉眼觀察后,剪去周圍大血管,在冰生理鹽水中洗凈血液,濾紙吸干,沿房室交界處去除左右心房,用電子天平(精確度0.000 1 g)稱取心室質(zhì)量(VW),再剪去右心室游離壁,保留左心室及室間隔,稱取左心室質(zhì)量(LVW),分別計(jì)算:心室質(zhì)量指數(shù) VWI(VW/BW)、左心室質(zhì)量指數(shù) LVWI(LVW/BW)。稱完后在乳頭肌水平下方室間隔及左室游離壁分別取全層心肌組織4～6塊(備用)。

1.5 心臟病理評(píng)分 所有標(biāo)本于10%甲醛中固定24 h(4℃),常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋,沿左室長軸線每隔 1 mm橫斷面切取5張(層厚4 μ m)切片,切片經(jīng) HE染色,Masson三色染色。光學(xué)顯微鏡下觀察:(1)心肌纖維有無肥大、變性、壞死;(2)間質(zhì)有無充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤、結(jié)締組織增生;(3)心內(nèi)膜和心外膜有無充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤。各種病變由輕到重的程度分別評(píng)分為1、2、3、4分,無病變?yōu)?分[3],累加每組每只動(dòng)物所有分?jǐn)?shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA斷片化 將所取心肌組織勻漿,蛋白裂解,進(jìn)行 DNA沉淀溶解后,在含有5 μ g/mL EB的1%agrose凝膠上電泳1 h后,用 UVP成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。電泳過程中用DNA maker指示DNA片段。

1.7 免疫印跡分析(Western blot analysis) 取冰凍心肌組織融化勻漿,蛋白裂解,離心,取上清液。蛋白定量用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)進(jìn)行測(cè)定,具體定量方法見試劑盒的說明書。不同分子質(zhì)量的蛋白樣品經(jīng)7.5%～15%的SDS-PAGE電泳分離,用半干法轉(zhuǎn)至PVDF(Millipore,USA)。轉(zhuǎn)移完后膜用麗春紅S(0.5%ponceaus S in 1%acetic acid)染色,洗滌,與化學(xué)發(fā)光底物(LumiGLO chemiluminescent substract system,KPL,Guildford,UK)共孵,然后與X光膠片在暗盒曝光5～30 min。沖洗膠片,掃描儀獲取圖像。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)程嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和操作指南(中國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布)以及本院制定的相關(guān)倫理規(guī)則,旨在減輕動(dòng)物所受痛苦并減少動(dòng)物的使用數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示,兩組間均數(shù)的比較采用方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般性狀 與正常組相比,對(duì)照組大鼠普遍出現(xiàn)以下現(xiàn)象:毛色暗黃,納食減少,體質(zhì)量先增加,后下降,運(yùn)動(dòng)緩慢,口、鼻發(fā)紺有血性分泌物,呼吸有明顯氣喘,足爪水腫,活動(dòng)減少,抓取反應(yīng)差。美托洛爾組經(jīng)治療后心衰癥狀較對(duì)照組好轉(zhuǎn)。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表1。與正常組相比對(duì)照組大鼠HR、LVEDP顯著增加(P＜0.01),LVSP及±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01);美托洛爾組與對(duì)照組大鼠相比 HR、LVEDP明顯下降(P＜0.05),±dp/dtmax明顯上升(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠VWI、LVWI及病理評(píng)分 VWI結(jié)果與正常組比較,對(duì)照組VWI、LVWI顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),左室重塑明顯;美托洛爾組 VWI、LVWI明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與對(duì)照組比較,美托洛爾組VWI、LVWI明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖1。病理評(píng)分結(jié)果,與對(duì)照組比較,對(duì)照組評(píng)分顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);美托洛爾組較對(duì)照組評(píng)分顯著下降(P＜0.01),見圖 1。

圖1 大鼠的VWI/LVWI結(jié)果及病理評(píng)分

圖2 各組大鼠肌細(xì)胞凋亡蛋白的改變

2.4 美托洛爾對(duì)心衰大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白的影響 如圖2所示,對(duì)照組大鼠心肌相關(guān)凋亡蛋白被明顯激活,Bax、活化形式的caspase-9和活化形式的caspase-3的合成均明顯增加,Bcl-2的合成則明顯下降。而美托洛爾明顯提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的合成,以及下調(diào)了促凋亡蛋白Bax的合成,并且凋亡通路中關(guān)鍵的分子caspase-9和caspase-3的活化均被藥物不同程度下調(diào)。

2.5 3組大鼠心肌DNA斷片化的改變 如圖3所示,與對(duì)照組相比美托洛爾組降低大鼠心肌組織的DNA梯狀條帶(DNA ladder)的出現(xiàn)。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞DNA斷片化的改變

3 討 論

CHE是各種心血管疾病的終末階段,預(yù)后嚴(yán)峻,文獻(xiàn)報(bào)道心衰的5年生存率與惡性腫瘤相仿[4]。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,細(xì)胞增殖相對(duì)較少,因此心肌細(xì)胞單元數(shù)量的穩(wěn)定對(duì)維持心功能具有重要的意義。在哺乳動(dòng)物,心肌細(xì)胞再生極為有限,一定數(shù)量心肌細(xì)胞的死亡,會(huì)影響整個(gè)心臟功能[5]。心衰的實(shí)質(zhì)是心室重構(gòu),而細(xì)胞凋亡在心室重構(gòu)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[6-7]。細(xì)胞凋亡是引起心室重構(gòu)及心功能下降的主要原因[8-9]。

細(xì)胞凋亡是遺傳基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程,是機(jī)體清除嚴(yán)重受損的細(xì)胞、不在需要的細(xì)胞和癌變細(xì)胞的自身防御性機(jī)制[10]。心肌細(xì)胞凋亡受包括Bcl-2家族蛋白的調(diào)控和胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等的激活和調(diào)控[11]。在Bcl-2家族蛋白中,Bcl-2、Mcl-1、Bcl-W 以及 Bcl-xl具有抑制細(xì)胞凋亡作用;而Bax、Bcl-xs、bak及bad則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2 protoonco-gene是一個(gè)抑制凋亡的原癌基因,而 Bax proto-oncogene是一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原癌基因,Bax與Bcl-2結(jié)合,阻止Bcl-2的激活,從而促進(jìn)凋亡,所以Bax、Bcl-2是調(diào)控心肌細(xì)胞的關(guān)鍵凋亡基因,兩者的比例決定心肌細(xì)胞在受到凋亡刺激后是死亡還是存活[8]。而氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超負(fù)荷和血管緊張素(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、內(nèi)皮素(ET)等神經(jīng)內(nèi)分泌激素的持續(xù)異常激活以及細(xì)胞因子如 TNF、干擾素-γ、IL-1、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等眾多因素也是引起細(xì)胞凋亡的重要因素[12]。而β受體阻滯劑美托洛爾能通過對(duì)調(diào)節(jié)凋亡蛋白及交感神經(jīng)活性、抑制循環(huán)中的兒茶酚胺類物質(zhì)的釋放、拮抗 ET-1、TNF-α等的活性,擴(kuò)張外周血管,阻斷粗細(xì)胞凋亡蛋白的合成,逆轉(zhuǎn)心室肥厚,延緩心衰的進(jìn)程[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射大劑量ISO方法復(fù)制CHF大鼠模型[15],對(duì)照組大鼠 LVSP、±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01),HR、LVEDP及VWI明顯上升(P＜0.01),并出現(xiàn)心室肥大。心肌DNA斷片化及心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)提高,心功能明顯受損,證實(shí)CHF的心肌有大量的心肌細(xì)胞凋亡。在應(yīng)用美托洛爾干預(yù)CHF大鼠后心肌細(xì)胞凋亡率減少。大鼠LVSP、±dp/dtmax明顯上升(P＜0.01);HR、LVEDP及 VWI明顯下降(P＜0.01);心室肥大明顯好轉(zhuǎn),心肌DNA斷片化改變及心肌凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下降,心功能明顯改善,說明心肌凋亡是CHF心肌細(xì)胞死亡及心功能下降的主要原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn),異丙基腎上腺素誘導(dǎo)CHF大鼠的心肌細(xì)胞凋亡顯著上調(diào),提示心肌細(xì)胞凋亡在實(shí)驗(yàn)性CHF的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。而美托洛爾具有抑制促細(xì)胞凋亡蛋白合成,從而降低心肌細(xì)胞凋亡,改善在實(shí)驗(yàn)性CHF大鼠的心功能及心室重構(gòu)。

[1] Teerlink JR,Pfeffer JM,Pfeffer MA.Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol-induced necrosis inrats[J].Circ Res,1994,75(1):105.

[2] Davani S,Marandin A,Mersin N,et al.Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype,enhance vascular density,and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model[J].Circulation,2003,108:253.

[3] Rona G,Chappel GI,Balazs T,et al.An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat[J].Arch Pathol,1959,67:443.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì),中華心血管病雜志編輯委員會(huì).慢性收縮性心力衰竭治療建議[J].中華心血管病雜志,2002,30(1):7.

[5] Sarkar S,Chawla-Sarkar M,Young D,et al.Myocardial cell death and regeneration during progression of cardiac hypertrophy to heart failure[J].J Biol Chem,2004,279(50):52630.

[6] Garg S,Narula J,Chandrashekhar Y.Apoptosis and heart failure:clinical relevance and therapeutic target[J].J M ol Cell Cardiol,2005,38(1):73.

[7] Van Empel VP,De Windt LJ.Myocyte hypertrophy and apoptosis:a balancing act[J].Cardiovasc Res,2004,63(3):487.

[8] Dorn GW 2nd.Apoptotic and non-apoptotic programmed cardiomyocyte death in ventricular remodelling[J].Cardiovasc Res,2009,81(3):465.

[9] Narula J,Haider N,Arbustini E,et al.Mechanisms of disease:apoptosis in heart failure-seeing hope in death[J].Nat Clin Pract Cardiovasc Med,2006,3(12):681.

[10]Yamashita M,Mizusawa N,Hojo M,et al.Extensive apoptosis and abnormal morphogenesis in pro-caspase-3 transgenic zebrafish during development[J].J Exp Biol,2008,211(Pt12):1874.

[11]Shimojo N,Jesmin S,Zaedi S,et al.Changes in important apoptosis-related molecules in the endothelin-1-induced hypertrophied cardiomyocytes:effect of the pretreatment with eicosapentaenoic Acid[J].Exp Biol Med(Maywood),2006,231(6):932.

[12]Gustafsson AB,Gottlieb RA.Mechanisms of apoptosis in the heart[J].J Clin Immunol,2003,23(6):447.

[13]Nagatomo Y,Yoshikawa T,Kohno T,et al.A pilot study on the role of autoantibody targeting the beta1-adrenergic receptor in the response to betablocker therapy for congestive heart failure[J].J Card Fail,2009,15(3):224.

[14]Prabhu SD,Wang G,Luo J,et al.Beta-adrenergic receptor blockade modulates Bcl-X(S)expression and reduces apoptosis in failing myocardium[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(5):483.

[15]Rona G,Chappel GI,Balazs T,et al.An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat[J].Arch Pathol,1959,67(4):443.

Effect of metoprolol on myocardial cell apoptosis in rats with ISO-induced congestive heart failure

ZHAOZhi-ming,GUO Han,J IAODong-dong,et al.
(Departmentof Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region,Nanjing,J iangsu210002,China)

ObjectiveTo explore the effect of metoprolol on myocardial cell apoptosis in rats with heart failure.Methods60 male Sprague-Dawley rats were randomly allocated to the ISO-induced chronic heart failure group(n=45)receiving two subcutaneous injections of 170 mg ISO per-kilogram of body and the healthy normal group(NOR group,n=15)receiving two subcutaneous injections of 0.25 mL normal saline.At 6-week,the left ventricular ejection fraction(LVEF)was measured by echocardiogram,the remaining rats,with left ventricular ejection fraction≤45%,were randomly divided into two groups:control group(n=13),metoprolol group(8 mg?kg-1? d-1,n=14),the drugs were given by gastric perfusion.At 18-week,then the hemodynamic parameters were detected,including heart rate,left ventricular end diastolic pressure,LV systolic pressure,LVWI was measured after LV morphopathological examination.The DNA fragmentation was detected by agarose gel electrophoresis method and the Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 were detected by Western blot analysis method.Results(1)Compared with the NOR group,the HR,LVEDP,LVWI and the DNA fragmentation Bcl-2,Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in the myocardial cells were significantly increased(P＜0.01).But LVSP and±dp/dtmaxand Bcl-2 were significantly decreased in the CON group.(2)Compared with the CON group,the HR,LVEDP,LVWI and the DNA fragmentation Bcl-2,Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in the myocardial cells were significantly decreased.The LVSP and±dp/dtmax and Bcl-2,significantly increased(P＜0.01)in the metoprolol group.ConclusionMetoprolol can inhibit myocardial cell apoptosis,improve heart function and reverse ventricular remodeling in rats with congestive heart failure.

metoprolol;congestive heart failure;SD rats;ISO;myocardial cell apoptosis

R365.541

A

1671-8348(2010)09-1039-03

2009-08-27

2009-09-06)

?論 著?