王海兵 綜述 陳曉峰 審校

目前，肺癌仍為人類因癌癥死亡的主要原因[1]，全世界每年有150萬人死于肺癌。臨床上肺癌患者就診時大多已屬中晚期，錯失手術機會，5年生存率不足15%[2]，肺癌如此高的死亡率與缺乏早期檢測手段及欠佳的治療措施有關，要想提高生存率，只有通過早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期手術治療等來實現(xiàn)。目前雖然對肺癌形成及發(fā)生發(fā)展機制已進行了大量研究與探索，但其確切機制尚未明確。許多研究[3-5]表明，DNA甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，DNA甲基化修飾異常也扮演著重要角色。了解DNA甲基化修飾異常在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機制，將有助于肺癌患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療并改善預后。本文就DNA甲基化修飾異常在肺癌中的研究進展綜述如下。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是基因表觀遺傳學修飾方式之一，可能存在所有高等生物中。在哺乳動物體內(nèi)，DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將胞嘧啶核苷酸（C）第5位碳原子甲基化變?yōu)?’-甲基胞嘧啶（5’-mC）的一種反應。而甲基胞嘧啶可以脫氨基轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），造成C-T突變進而導致某些基因突變而失活，這個過程調(diào)控了基因的表達。DNA甲基化常發(fā)生于CG二核苷酸密集區(qū)，這些區(qū)域被稱為CpG島，健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態(tài)，而CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的，這種甲基化的存在形式在細胞分裂過程中能夠穩(wěn)定保留[6]，并可以遺傳，是維持高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因素。當一些抑癌基因CpG島中的CpG序列呈高甲基化狀態(tài)時，其可致染色體螺旋程度增加及抑癌基因沉默和表達缺失[7]，引發(fā)腫瘤生長。DNMTs在整個初始甲基化及甲基化的維持中發(fā)揮著重要作用，目前認為DNMTs主要包括DNMTl、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b共4個成員，其中DNMT1負責準確復制DNA甲基化形式，起著維持甲基化的作用，DNMT2最初被認為是一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶[8]，但是最近研究[9]發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)tRNA的甲基化，DNMT3a和DNMT3b被認為是從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要負責非甲基化CpG位點的甲基化。DNA甲基化對基因表達的影響需要一些甲基化的CG序列結(jié)合蛋白（methyl-CpG-binding domain protein, MBDs）共同參與[10]，這些活性蛋白通過恢復組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)酶作用促使染色質(zhì)纖維由10 nm的疏松結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€濃聚的30 nm的螺旋結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。DNA甲基化狀態(tài)可受感染、環(huán)境以及營養(yǎng)因素的影響，但其機制還不清楚，可能是這些因素能影響DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的合成、活性和作用靶點，或者影響MBDs和脫甲基酶。

2 DNA甲基化與肺癌

到目前為止，在肺癌患者中已檢測出大量基因發(fā)生甲基化，大部分研究是基于外科手術獲得的非小細胞肺癌樣本。目前非小細胞肺癌樣本中集中研究的基因包括p16、RASSF1A、CDH1、CDH13、APC、RARβ、DAPK和MGMT[11]。其中p16基因位于人第9條染色體p21區(qū)，參與細胞周期蛋白調(diào)控，通過與細胞周期蛋白依賴激酶CDK4及CDK6結(jié)合而抑制后者活性，進而抑制細胞增殖，是一種重要的抑癌基因，其失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，p16啟動子區(qū)5’-CpG島甲基化是其失活的重要原因，在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。肺癌中p16基因甲基化頻率各學者報道不同，在肺癌組織中甲基化發(fā)生率大多在17%-80%，在肺癌患者血液中其發(fā)生率大多在13%-77.8%；Ras相關區(qū)域家族1A（RASSF1A）是人類腫瘤中甲基化頻率最高的一個抑癌基因，RASSF1A主要參與細胞周期的調(diào)節(jié)，該基因甲基化與肺癌發(fā)生發(fā)展及預后關系密切。綜合近幾年報道，RASSF1A在原發(fā)非小細胞肺癌中甲基化率在30%-40%，在小細胞肺癌中甲基化率幾乎可以達到80%[12]。Tomizawa等[13]報道110例I期肺腺癌患者RASSF1A甲基化率為35%，且分化差的腫瘤比高分化和中分化的腫瘤甲基化頻率高。最近張卉等[14]報道，非小細胞肺癌組織中RASSF1A啟動子甲基化率為38.7%，20例肺良性病變中無一例發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動子甲基化。Wang[15]研究發(fā)現(xiàn)deltaDNMT3B4的表達與RASSF1A啟動子甲基化狀態(tài)密切相關，他們通過RNA干擾技術敲除非小細胞肺癌細胞株中的deltaDNMT3B4而導致RASSF1A啟動子去甲基化而復活；CDH1、CDH13基因均屬于鈣粘蛋白家族，CDH1編碼的蛋白E-cadherin是一跨膜糖蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面起重要作用，是公認的浸潤轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因啟動子區(qū)CpG島甲基化是E-cadherin失活的重要機制，目前報道的非小細胞肺癌中CDH1基因啟動子CpG島甲基化率在15%-46%。王紅兵等[16]最近報道在肺癌組織中CDH1基因甲基化率為40.9%，明顯高于癌旁組織和正常組織，提示CDH1啟動子CpG島甲基化可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。CDH13基因是鈣粘家族的又一成員，編碼蛋白H-cadherin，起著抑癌基因作用，啟動子區(qū)CpG島甲基化是H-cadherin失活的重要機制；APC可抑制β-catenin，是家族性或散發(fā)性結(jié)腸癌相關抑癌基因，其啟動子因甲基化而失活在肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用也被證實。Brabender[17]報道在非小細胞肺癌組織中APC甲基化率高達94%，而正常對照組僅20%發(fā)生甲基化。RAR-β主要調(diào)節(jié)細胞生長過程。Virmani等[18]報道RAR-β基因甲基化率為28%，且與腫瘤細胞分化程度密切相關，在非小細胞肺癌患者的預后方面具有臨床參考價值；死亡相關蛋白激酶DAPK基因作為抑癌基因具有調(diào)節(jié)凋亡的功能，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，其因啟動子甲基化而表達缺失可導致多種腫瘤發(fā)生。O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）是一種高效修復酶，能修復DNA序列中6-氧-甲基鳥嘌呤損傷，對維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義，該基因的表達缺失可以導致肺癌的發(fā)生發(fā)展，其啟動子區(qū)甲基化是MGMT去表達的重要機制。Esteller等[19]報道非小細胞肺癌組織標本中MGMT甲基化發(fā)生率為29%?？自泼鞯萚20]報道肺癌患者血漿標本中MGMT甲基化率為24.62%。研究[21]發(fā)現(xiàn)MGMT啟動子甲基化可能與p53突變相關。另外，與非小細胞肺癌相關的甲基化基因還有：FHIT、HIC-1、AKAPl2、ESRl、CYGB、OPCML、ADAMTSl、TGFBI、RUNX3、UMDl、hSRBC、CADM1、p14ARF、p16INK4a、DAPK、GSTP1、MGMT、MLH1、FBN2、DAL-1、ASC等[22-28]。

最新發(fā)現(xiàn)的幾個肺癌相關基因甲基化如下：Zhang等[29]研究了78對非小細胞肺癌組織、癌旁組織及25個良性病變組織發(fā)現(xiàn)DLEC1基因甲基化率分別為41%、3.8%和0，DLEC1甲基化程度與肺癌分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關。他們還檢測了肺癌患者血漿樣本中DLEC1甲基化率為35.9%，而非癌患者血漿中該基因甲基化率僅為2%，DLEC1在血漿中甲基化狀態(tài)和組織中一致性較好。DLEC1基因啟動子甲基化在肺癌組織中表達沉默，而在癌旁和良性病變組織中則廣泛表達。Nagji等[30]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1, BRMS1）的mRNA和蛋白表達在非小細胞肺癌中明顯降低，他們發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌樣本BRMS1啟動子甲基化率明顯高于癌旁組織，在鱗癌中該差別更明顯。BRMS1啟動子甲基化與臨床病例特征聯(lián)系分析得知在鱗癌中BRMS1甲基化與病理分期相關。Suzuki等[31]檢測了17個非小細胞肺癌細胞株和236個非小細胞肺癌組織標本中CXCL12的mRNA和甲基化狀況發(fā)現(xiàn)，CXCL12在236個肺癌組織中甲基化率為36%，CXCL12甲基化狀態(tài)和其表達顯著相關。他們認為CXCL12沉默在非小細胞肺癌中是個頻繁的事件。Chang等[32]研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中RECK啟動子甲基化率為63.6%，其表達下調(diào)與該基因啟動子甲基化密切相關，K-ras基因的密碼子12在肺癌組織中突變率為25.5%，統(tǒng)計分析顯示K-ras突變與RECK啟動子甲基化密切相關，他們認為在非小細胞肺癌中RECK下調(diào)是由于啟動子甲基化引起的，且與K-ras突變和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。Yu等[33]報道，EPHB6啟動子甲基化引起基因表達下調(diào)，在非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其高甲基化狀態(tài)可增加非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移的風險。Rui等[34]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BLN-3基因在非小細胞肺癌組織中甲基化率為43.1%，比相應正常組織甲基化率（9.2%）明顯增高，且FBLN-3高甲基化與其mRNA和蛋白水平表達下調(diào)相關，研究還表明FBLN-3甲基化狀態(tài)與肺癌分化程度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。

目前大多數(shù)甲基化研究大多集中在非小細胞肺癌中，而對小細胞肺癌的研究較少。Kreisler等[35]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元抑制沉默因子/RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子（neuron restrictive silencer factor or RE1-silencing transcription factor,NRSF/REST）是小細胞肺癌進展的一個重要調(diào)節(jié)劑，在小細胞肺癌中NRSF/REST本身起腫瘤抑制因子作用，NRSF/REST因自身甲基化和CREB調(diào)節(jié)而失活，NRSF/REST的丟失導致表皮生長因子介導的AKT磷酸化，對細胞增生和生存有重要意義。Wang等[36]用Illumina Beadchip assay檢測了44對小細胞肺癌和對照組外周血白細胞DNA的52個基因的62個CpG位點甲基化表達差異，并用pyrosequencing技術驗證了9個CpG位點，統(tǒng)計分析甲基化差異發(fā)現(xiàn)這9個CpG位點甲基化預示一個較高的小細胞肺癌危險度，可能有助于小細胞肺癌的風險預測和診斷。他們發(fā)現(xiàn)CSF3R和ERCC1甲基化聯(lián)合檢查對區(qū)別小細胞肺癌和對照組意義較大。

3 DNA甲基化在肺癌中的應用

3.1 DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應用 目前肺癌相關基因甲基化異常不僅在肺癌組織中被檢測[29-31]，在肺癌患者的血清或血漿[37,38]、痰[39,40]、支氣管刷檢和活檢標本[41,42]中也能夠檢測到，最近Han等[43]認為DNA甲基化能夠在呼出氣的冷凝液中檢測到。這些樣本的最大好處是較易獲得，在這些樣本中檢測DNA甲基化對肺癌早期檢測及診斷具有潛在的用途。Licchesi等[44]對癌旁正常組織、肺腺瘤型增生過長組織（癌前病變）及相應的肺腺癌組織中7個基因甲基化進行研究，發(fā)現(xiàn)甲基化的頻率從正常組織到肺腺瘤型增生過長組織（癌前病變）再到腺癌是明顯增加的。這證明某些基因的甲基化可能是肺癌發(fā)展中的一個早期標志，且甲基化程度隨惡性演變而增加。同時對幾個基因的甲基化檢測可能成為肺癌早期檢測和風險評估的一個生物指標。

3.2 DNA甲基化在預測肺癌復發(fā)及預后中的應用 有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與肺癌的復發(fā)情況相關，Brock等[45]研究了I期非小細胞肺癌術后血中DNA甲基化與肺癌復發(fā)情況的關系發(fā)現(xiàn)在肺癌組織和非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中p16、CDH13、RASSF1A和APC的甲基化狀態(tài)與肺癌的復發(fā)情況相關，如果p16和CDH13在腫瘤組織和縱隔淋巴結(jié)中被檢測是高甲基化狀態(tài)，則其復發(fā)的優(yōu)勢比為15.5，作者認為這些基因在正常淋巴結(jié)中高甲基化提示可能存在顯微鏡無法檢測到的微轉(zhuǎn)移灶，某些基因的高甲基化可能使細胞具有轉(zhuǎn)移擴步的潛性，對預測疾病的復發(fā)情況可能有意義。原發(fā)性非小細胞肺癌中某些基因的甲基化可作為其預后不良的一個指標。Tang等[46]報道DAPK甲基化狀態(tài)與I期非小細胞肺癌患者的生存密切相關，這些發(fā)現(xiàn)在后來也被Lu等[47]研究證實。Burbee[48]和張卉[14]報道RASSF1A基因甲基化可作為非小細胞肺癌預后不良的一個指標。Kim[49]以及Tomizawa[13]也報道RASSF1A甲基化可作為I期肺腺癌預后不良的一個指標。Toyooka等[50]報道p16的甲基化狀態(tài)與肺腺癌的預后不良顯著相關。在I期非小細胞肺癌中，Yanagawa[51]發(fā)現(xiàn)RASSF1A和RUNX3甲基化與預后不良有關。Brabender[17]報道APC基因啟動子區(qū)高甲基化與患者低生存率相關。Seng等[52]研究也發(fā)現(xiàn)DLEC1甲基化在原發(fā)性非小細胞肺癌中（包括鱗癌）是一個獨立的預后指標，hMLH1甲基化是影響大細胞肺癌預后的一個指標。Nagji等[30]認為BRMS1是非小細胞肺癌一個預后不良的指標。 Suzuki等[31]分析顯示CXCL12甲基化與非小細胞肺癌患者預后密切相關，對CXCL12的甲基化分析可能成為非小細胞肺癌患者術后預后指標。

3.3 DNA甲基化的逆轉(zhuǎn)在肺癌治療中的應用 基于DNA甲基化導致抑癌基因沉默促使腫瘤發(fā)生的機理，用能夠逆轉(zhuǎn)甲基化的藥物改變沉默基因的甲基化狀態(tài)是目前一直在研究的用來治療肺癌的一種手段。過去幾年里，逆轉(zhuǎn)基因甲基化改變的方法或藥物已有報道，主要包括腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和非腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑。5-氮雜胞苷和5-氮-2'-脫氧胞苷作為腺苷類DNMT抑制劑通過共價鍵與DNMT形成穩(wěn)定的中間體而使DNMT失活，導致DNA去甲基化和沉默基因重新表達。目前該類藥物主要用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。非腺苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑主要是抑制DNMT活性，其主要包括EGCG（一種多酚化合物）、MG98（一種反義寡核苷酸）、普魯卡因、普魯卡因胺和肼屈嗪等。此外，還有些去甲基化的研究如：小分子干擾RNA（small interfering RNAs, siRNA）通過與DNMT mRNA結(jié)合導致其降解和基因沉默，從而使DNA發(fā)生去甲基化[53]。這些研究有望為肺癌治療提供一種新方法。

4 結(jié)語

DNA異常甲基化與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，肺癌在其發(fā)生與發(fā)展過程中存在一系列基因異常甲基化。通過檢測多個基因甲基化情況可對肺癌進行早期檢測、診斷和判斷復發(fā)及預后情況，同時了解DNA甲基化修飾異常在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機制，可以用去甲基化藥物使甲基化沉默基因重新表達，有望為肺癌的臨床治療提供新方法。然而其在肺癌診斷及治療中的應用還存在一些問題，如目前甲基化研究多基于腫瘤組織，雖在血漿、痰和其它樣本中也可檢測到，但其靈敏性和特異性不如腫瘤組織，且在血液中不一定有足夠能檢測到的腫瘤DNA，特別在腫瘤的早期階段，還有血液中的腫瘤標記物沒有器官特異性，不能判斷一定是肺癌；痰標本在吸煙人群較易獲得，但在不吸煙人群不易獲得[11]，且來自肺中央的痰標本不一定能夠檢測出周圍型肺癌。另外，雖同時對多個基因甲基化檢測比檢測一個基因?qū)Ψ伟┰\斷的敏感性和特異性高，但是哪一組基因甲基化有較高靈敏度和特異性，這些都是肺癌診斷中存在的問題?；蛉ゼ谆委熌[瘤也存在一些問題，如去甲基化藥物雖可以改變DNA甲基化模式，但由于其可逆性的特征，同樣有可能恢復到原始的甲基化狀態(tài)，且長時間大劑量給予甲基化抑制劑可能產(chǎn)生嚴重的毒副作用，如惡心、嘔吐、骨髓抑制、甚至基因突變導致其它腫瘤發(fā)生等。因此對于晚期肺癌患者，是否將去甲基化藥物用于腫瘤治療還有待進一步研究。