張定勇，孫蕾，楊利敏，劉文軍

中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所分子病毒中心，北京 100101

抗菌肽通常是由小于 50個(gè)氨基酸的氨基酸殘基組成的具有重要生物學(xué)活性的小分子多肽，是生物先天性免疫的重要組成部分。不同物種的抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)有相似之處，含有至少 2個(gè)正電荷氨基酸以及一定比例的疏水氨基酸[1]。防御素是一類分子量約為4.0~5.0 kDa，含有6個(gè)半胱氨酸殘基，3對(duì)二硫鍵的陽(yáng)離子抗菌肽。豬 β-防御素 2 (Porcine Beta-Defensin 2，PBD-2) 是新發(fā)現(xiàn)的一種β-防御素，預(yù)測(cè)其成熟肽有 37個(gè)氨基酸，化學(xué)合成的 PBD-2活性分析表明其具有廣譜抗菌作用[2-4]，但利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。γ干擾素是由激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。豬γ干擾素 (Porcine interferongamma，PoIFNγ) 全基因?yàn)?501個(gè)堿基，編碼 166個(gè)氨基酸，前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，后143個(gè)氨基酸為成熟多肽，推測(cè)含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)[5-7]。1990年，Dijikmans等首先對(duì)PoIFNγ基因進(jìn)行了研究[8]。迄今為止，PoIFNγ已在不同表達(dá)系統(tǒng)中獲得了表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母 Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)是一種重要的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，迄今為止，已有多種蛋白在該系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)[9-10]。融合蛋白 (Fusion protein，F(xiàn)P) 技術(shù)通過(guò)人工手段有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因連接在一起，進(jìn)而表達(dá)所需要的蛋白。利用此技術(shù)可以構(gòu)建和表達(dá)可能具有多種功能的新型目的蛋白，同時(shí)還有可能提高原蛋白的表達(dá)量。將抗菌肽單獨(dú)進(jìn)行表達(dá)后，一般表達(dá)量低，純化困難，而將其串聯(lián)融合后可顯著提高表達(dá)量[11-12]，但抗菌肽與其他蛋白融合表達(dá)的報(bào)道較少。目前已有關(guān)于 γ干擾素融合蛋白的報(bào)道，一般在融合蛋白中作為免疫佐劑發(fā)揮功能[13-14]，但 PoINFγ在畢赤酵母中的表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)，如果抗菌肽與干擾素融合后能獲得高產(chǎn)量且抑菌抗病毒活性的融合蛋白和高產(chǎn)量的PoINFγ，將具有積極的意義。在此假設(shè)的基礎(chǔ)上，我們將通過(guò)畢赤酵母分泌表達(dá)PBD-2-PoINFγ融合蛋白與PoINFγ，并對(duì)它們的活性進(jìn)行分析，同時(shí)為大規(guī)模生產(chǎn)PoINFγ作好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 載體、菌株、病毒和細(xì)胞株

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA和P. pastoris表達(dá)菌株X33購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌E. coli DH5α、vesicular stomatitis virus (VSV) 及 Madin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶與主要試劑

限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I和Sac I，Pfu 聚合酶和T4 DNA 連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；酵母提取物、蛋白胨和酵母氮源堿購(gòu)自O(shè)xoid公司；DL5000 DNA marker、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京諾派生物科技有限公司；INFγ多克隆抗體和INFγ標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù) Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中豬 β防御素(Q6R953) 和豬γ干擾素成熟肽 (P17803) 氨基酸序列，利用DNAworks在線軟件[15]，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性[16]，自動(dòng)合成14條引物 (表1)，經(jīng)基因重疊延伸 PCR (Gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)[17-18]將上述兩基因融合，PBD-2置于融合蛋白N端，PoIFNγ置于融合蛋白C端 (圖1)。

圖1 融合基因序列結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Sequence structure schematic of PBD-2-PoIFNγ fusion gene.

表1 融合基因引物Table 1 Primers for fusion gene

引物由北京博邁德生物科技有限公司合成，其中在引物P1的5′端引入Xho I限制性酶切位點(diǎn)和α信號(hào)肽裂解位點(diǎn)Kex2 (aaaaga)，在引物P14的5′端引入Xba I酶切位點(diǎn)和終止子 (taa)。通過(guò)5次PCR反應(yīng)合成融合基因PBD-2-PoIFNγ。其中第1次PCR反應(yīng)以P1、P2、P3、P4互為模板引物；第2次PCR反應(yīng)以P5、P6、P7、P8互為模板引物；第3次PCR反應(yīng)以P9、P10、P11、P12、P13、P14互為模板引物；第4次PCR反應(yīng)以第1次和第2次PCR產(chǎn)物為模板，引物為P1和P8；第5次PCR反應(yīng)以第3次和第4次PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物為P1和P14。利用融合基因序列，設(shè)計(jì)2條引物PorF和PorR以合成的融合基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增PoIFNγ基因。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用 Xho I與 Xba I雙酶切融合基因 PBD-2-PoINFγ、PoIFNγ基因和載體pPICZαA，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切膠回收后在 16℃連接過(guò)夜，分別轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后，送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZαA-PBD- 2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ。

1.2.3 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化和電擊轉(zhuǎn)化

用 Sac I單酶切 5~10 μg的 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ和pPICZαA-PoIFNγ重組表達(dá)質(zhì)粒使之線性化，參照 Easy SelectTMPichia Expression Kit操作說(shuō)明書(shū)將P. pastoris X33制備成感受態(tài)細(xì)胞，取出90 μL分別與10 μL (500 ng/μL) 線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ及 pPICZαA-PoIFNγ混合，使用Bio-Rad Gene Pulser 電轉(zhuǎn)儀于1.5 kV、25 μF和 200 ?條件下電轉(zhuǎn)化，立即加入 1 mL (1 mol/L) 冰浴山梨醇。轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞涂布YPDS平板 (ZeocinTM抗性濃度為 100 μg/mL)，30℃培養(yǎng)2~4 d。

1.2.4 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗性菌株的篩選與鑒定

將在 YPDS平板上長(zhǎng)出的 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ單菌落分別轉(zhuǎn)移到含高濃度ZeocinTM平板上(濃度為800 μg/mL) 進(jìn)行篩選，將在高抗性平板上長(zhǎng)出的菌落接種到5 mL YPD液體培養(yǎng)基 (ZeocinTM抗性濃度為100 μg/mL) 中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜；提取陽(yáng)性酵母基因組DNA (TIANGEN)，以原始菌和空白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌基因組作對(duì)照，分別以PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因特異性引物，進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定陽(yáng)性的重組子用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.5 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

將PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗陽(yáng)性重組酵母菌分別按1∶50接種到5 mL BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至 OD600=5~6，菌體離心后重懸于 20 mL BMMY培養(yǎng)基，體積濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集24、48、72 h誘導(dǎo)表達(dá)上清液，經(jīng)TCA法濃縮后用SDS-PAGE初步檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

1.2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與PoIFNγ的初步純化與鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)上清液濃縮與脫鹽: 收集100 mL誘導(dǎo)表達(dá)上清液，分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和 90%飽和度的(NH4)2SO4進(jìn)行濃度梯度鹽析沉淀，4℃放置2 h后12 000 r/min離心 10 min，沉淀產(chǎn)物分別溶于 2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 中，SDS-PAGE檢測(cè)沉淀結(jié)果。

Superdex 75TM分子篩層析純化融合蛋白PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ：綜合比較在不同濃度梯度下的沉淀結(jié)果，將含蛋白量大且雜蛋白少的沉淀進(jìn)行透析脫鹽處理，然后再用10 kDa超濾濃縮管進(jìn)行處理，去除小分子雜質(zhì)，得到500 μL樣品。在AKATA系統(tǒng)上用0.5 mL/min 的緩沖液 (0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0) 平衡Superdex 75TM柱，然后以0.2 mL/min上樣500 μL，再用同一緩沖液以0.2 mL/min進(jìn)行洗脫，出現(xiàn)洗脫峰后收集樣品，將收集的純化產(chǎn)物分別進(jìn)行 SDS-PAGE與 Western blotting檢測(cè)。Western blotting的一抗為PoIFNγ多抗 (1∶5 000稀釋)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG (1∶2 500稀釋)。

1.2.7 PBD-2-PoINFγ融合蛋白與PoINFγ的活性檢測(cè)

瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白的抑菌活性：將25 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E. coli DH5α與55℃ LB固體培養(yǎng)基25 mL混勻后鋪平板，待其凝固后，用滅菌的打孔器 (直徑5 mm) 打孔，滴加100 μL待測(cè)的融合蛋白樣品，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以同體積pPICZαA空載體轉(zhuǎn)化的X33酵母表達(dá)蛋白為陰性對(duì)照，10 μL Kana (25 μg/mL) 為陽(yáng)性對(duì)照。第2天測(cè)量抑菌直徑 (抑菌直徑=抑菌圈直徑?加樣孔直徑)。

細(xì)胞病變抑制法測(cè)定 PBD-2-PoINFγ融合蛋白與 PoINFγ的抗病毒活性：以含有 10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，傳代2次。用完全培養(yǎng)基稀釋成每1 mL含2.5×105~3.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞板中，每孔100 μL，于同上的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 h。將配制的干擾素標(biāo)準(zhǔn)品、PoINFγ和 PBD-2-PoINFγ樣品溶液移入接種MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL。培養(yǎng)18~24 h，棄去培養(yǎng)板中的上清，加入水泡性口炎病毒 (VSV，?80℃保存)，用含 3%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至100 TCID50，每孔100 μL。同樣條件下培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行染色和脫色。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光值。以干擾素標(biāo)準(zhǔn)品為參照，計(jì)算PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的效價(jià)。

1.2.8 圓二色譜測(cè)定PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級(jí)結(jié)構(gòu)

用pH 8.0的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液將純化的 PoIFNγ和 pBD-2-PoIFNγ分別配成濃度為0.2 mg/mL的溶液，在Jasco (J-810) 圓二色譜儀上測(cè)CD譜，掃描區(qū)域?yàn)檫h(yuǎn)紫外190~260 nm，樣品池光程為1 mm。

2 結(jié)果

2.1 PBD-2-PoIFNγ融合基因與 PoIFNγ基因的PCR擴(kuò)增

將 PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA DL5000 marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分別獲得了大小約為560 bp和460 bp的擴(kuò)增帶，與預(yù)期PBD-2-PoIFNγ融合基因 (圖 2A) 與 PoINFγ基因(圖2B) 片段大小相符。

圖2 PBD-2-PoIFNγ融合基因 (A) 與PoIFNγ基因 (B) PCR擴(kuò)增結(jié)果 (B)Fig. 2 Fusion gene of PBD-2-PoIFNγ (A) and gene of PoIFNγ (B) amplified by PCR. M: DNA DL 5000 marker; 1: fusion gene of PBD-2-PoIFNγ; 2: gene of PoIFNγ.

2.2 PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，提取質(zhì)粒，用Xho I和Xba I雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得了預(yù)期目的條帶 (圖略)。測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)載體中PBD-2-PoIFNγ融合基因與PoIFNγ基因序列未發(fā)現(xiàn)突變堿基，且閱讀框正確，表明成功構(gòu)建含有目的基因的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ與pPICZαA-PoIFNγ。

2.3 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ陽(yáng)性重組表達(dá)酵母菌株的PCR鑒定

利用 PBD-2-PoIFNγ融合基因特異性引物對(duì)(P1和P14) 和PoIFNγ特異性引物對(duì) (PorF和PorR)分別對(duì) ZeocinTM抗性平板篩選出的 PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ酵母菌株進(jìn)行PCR鑒定。從圖3中可以看出，分別擴(kuò)增出約560 bp (圖3A) 和460 bp (圖3B) 的片段，均與理論大小相符，表明線性化的pPICZαA-PBD-2-PoIFNγ與 pPICZαA-PoIFNγ成功與酵母菌X33染色體基因組整合。

圖3 PBD-2-PoIFNγ (A) 與PoIFNγ (B) 重組酵母菌株的PCR鑒定Fig. 3 Identification of recombinant yeast of PBD-2-PoIFNγ (A) and PoIFNγ (B) by PCR. M: DNA DL5000 marker; 1: negative control; 2: positive control; 3: positive yeast of PBD-2-PoIFNγ, 560 bp fragment amplified with specific primer; 4: positive control; 5: negative control; 6: positive yeast of PoIFNγ, 460 bp fragment amplified with specific primer.

2.4 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ的誘導(dǎo)表達(dá)

將選出的PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ高抗陽(yáng)性酵母菌株以及陰性對(duì)照菌 X33和只轉(zhuǎn)入空載體pPICZαA的陰性對(duì)照菌分別在含 0.5%(V/V)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心取上清，濃縮后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。都發(fā)現(xiàn)兩條明顯特異性條帶，與理論大小相符，而陰性對(duì)照菌和轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照菌未見(jiàn)相應(yīng)條帶 (圖略)。

2.5 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與PoIFNγ的初步純化與鑒定

2.5.1 誘導(dǎo)表達(dá)上清的鹽析與脫鹽

將陽(yáng)性PBD-2-PorIFNγ重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)上清分別用 20%~90%飽和度(NH4)2SO4沉淀后，用pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl溶解，SDS-PAGE檢測(cè)沉淀產(chǎn)物 (圖4)。其中在70% (NH4)2SO4濃度時(shí)得到的PBD-2-PoIFNγ沉淀量最大，但雜蛋白也較多。而在 50% (NH4)2SO4濃度時(shí)得到的 PBD-2-PoIFNγ純度較高，雜蛋白較少，經(jīng)透析后可以直接用分子篩進(jìn)行純化，得到純度更高的目的蛋白。而PoIFNγ重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)上清直接用50% (NH4)2SO4濃度進(jìn)行沉淀，經(jīng)相同處理后進(jìn)行分子篩純化。

2.5.2 Superdex 75TM分子篩層析純化PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ

含PBD-2-PoIFNγ或PoIFNγ的濃縮脫鹽樣品分別經(jīng)Superdex 75TM分子篩層析處理后，將收集液進(jìn)行 SDS-PAGE和 Western blotting。圖 5 (PBD-2-PoIFNγ) 中主要有2個(gè)洗脫峰，第1個(gè)峰為雜蛋白峰，第 2個(gè)峰為目的蛋白峰。從圖6A和圖 6B的SDS-PAGE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)2條無(wú)法分開(kāi)的蛋白條帶，Western blotting 分析檢測(cè)也是如此，說(shuō)明這 2條帶都能有效結(jié)合PoIFNγ多克隆抗體，據(jù)此推測(cè) PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ以兩種形式存在。

圖4 硫酸銨鹽析PBD-2-PoIFNγ的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE of PBD-2-PoIFNγ by salting-out lane with ammonium sulphate. M: protein marker; 1–8: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% (NH4)2SO4.

圖5 Superdex 75TM分子篩層析純化pBD-2-PoIFNγFig. 5 Purification of pBD-2-PoIFNγ by Superdex 75TM size-exclusion chromatography. P1: peaks of other protein; P2: elute peaks of target protein.

圖6 純化的PBD-2-PoIFNγ (A) 與PoIFNγ (B) SDS-PAGE和Western blotting分析Fig. 6 SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) analysis of purified PBD-2-PoIFNγ. M: protein marker; 1: sample of PBD-2-PoIFNγ; 2: purified PBD-2-PoIFNγ; 3: identification of purified PBD-2-PoIFNγ by Western blotting; 4: sample of PoIFNγ; 5: purified PoIFNγ; 6: identification of purified PoIFNγ by Western blotting.

2.6 PBD-2-PoIFNγ融合蛋白與 PoIFNγ的活性檢測(cè)

細(xì)胞病變抑制法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示測(cè)定的 PoIFNγ效價(jià)達(dá)到 105~106U/mg。陰性對(duì)照和經(jīng)不同濃度梯度的融合蛋白處理的MDBK細(xì)胞都出現(xiàn)了病變，而標(biāo)準(zhǔn)INFγ處理過(guò)的MDBK細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生病變；瓊脂孔穴擴(kuò)散測(cè)定結(jié)果表明融合蛋白并不能抑制大腸桿菌DH5α，融合蛋白pBD-2-PoIFNγ沒(méi)有像單獨(dú)的pBD-2一樣具有廣譜的抑菌作用。

2.7 圓二色譜測(cè)定PBD-2-PoIFNγ與PoIFNγ的二級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)純化的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ進(jìn)行圓二色譜測(cè)量，測(cè)定的 CD譜圖利用 Secondary Structure Estimation軟件包對(duì)其CD譜進(jìn)行最小二乘法修正計(jì)算和擬合 (圖7)，表2列出了用圓二色譜法測(cè)定的PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，從計(jì)算結(jié)果中可以看到片層和轉(zhuǎn)角含量相差不大，而螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量差別較大，可推測(cè)是部分螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲影響了 PBD-2-PoIFNγ的抗病毒活性。

表2 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較Table 2 Comparison of the secondary structures of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ

圖7 PoIFNγ和PBD-2-PoIFNγ的CD圖譜Fig. 7 CD spectra of PoIFNγ and PBD-2-PoIFNγ.

3 討論

通常融合基因的拼接大多采用限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理的方法得到，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，非常不方便，而重疊延伸PCR技術(shù)能快速獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的基因產(chǎn)物。該技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)，DNAWORKS程序能根據(jù)密碼子偏愛(ài)性，方便、準(zhǔn)確地指導(dǎo)寡核苷酸的設(shè)計(jì)，能最大限度地減少引物“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)形成，使體外基因拼接工作更易進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DNAWORKs設(shè)計(jì)14條引物，根據(jù)SOE法原理分 5次 PCR方便地合成了融合蛋白基因PBD-2-PoIFNγ。在融合基因序列基礎(chǔ)上，我們擴(kuò)增出了PoIFNγ基因的序列，并用相同載體和酵母菌實(shí)現(xiàn)了PBD-2-PoIFNγ融合蛋白和PoIFNγ的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中所使用的P. pastoris菌株X33是野生型，耐受性比較好，在含甲醇的培養(yǎng)基中能快速生長(zhǎng)，表達(dá)載體pPICZαA含有α-MF信號(hào)肽序列，在信號(hào)肽序列和目的蛋白序列之間引入Kex2蛋白酶切位點(diǎn)，可以在目的蛋白質(zhì)分泌到胞外時(shí)將信號(hào)肽切除[19]。由于酵母分泌表達(dá)得到大量的上清液，內(nèi)含一些雜質(zhì)，直接進(jìn)行分離純化并不方便，通過(guò)鹽析方法，可以將蛋白質(zhì)在保持活性的前提下得到濃縮和粗分離。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)硫酸銨分級(jí)梯度沉淀法，獲得了較佳蛋白沉淀量但雜蛋白較少時(shí)的飽和硫酸銨濃度，在該濃度下將含有融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ的上清液進(jìn)行濃縮，透析脫鹽后，經(jīng)過(guò)一次分子篩純化即可得到純度較高的蛋白。通過(guò)SDS-PAGE和 Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論P(yáng)BD-2-PoIFNγ融合蛋白還是PoIFNγ都有2條明顯的條帶，因?yàn)镻oIFNγ上具有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，推測(cè)這2條帶可能是糖基化水平不同造成的。

本實(shí)驗(yàn)將純化后的融合蛋白 PBD-2-PoIFNγ通過(guò)細(xì)胞病變抑制法和瓊脂孔穴擴(kuò)散法進(jìn)行了活性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白沒(méi)有抗病毒和抑菌效果，但非融合的PoIFNγ具有很好的抗病毒效果。原因分析如下：抗菌肽 N末端有較強(qiáng)的形成兩親α螺旋的趨勢(shì)，帶電荷氨基酸均在螺旋一側(cè)分布；C端有形成疏水螺旋的傾向[1,20]。目前被學(xué)界比較認(rèn)可的抗菌肽作用機(jī)制是:首先抗菌肽的多聚體與細(xì)胞膜相互吸引使抗菌肽結(jié)合到膜上；然后抗菌肽的疏水C端插入膜中，而形成兩親α螺旋的N端留在膜界面上；最后兩親性的α螺旋插入質(zhì)膜，在質(zhì)膜上形成較大孔洞，從而使細(xì)胞死亡。由于PBD-2是置于融合蛋白N端，而C端連接具較長(zhǎng)肽鏈的PoIFNγ，使其C端不能插入到膜中，從而無(wú)法使其N端與細(xì)菌表面相互作用而失去活性[21]。通過(guò)圓二色譜分析發(fā)現(xiàn)，PoIFNγ和pBD-2-PoIFNγ的二級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋差別較大，推測(cè)可能是部分螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲影響了PBD-2-PoIFNγ的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了其抗病毒活性。融合蛋白中的PBD-2和PoIFNγ都帶有很強(qiáng)的正電荷，但由于當(dāng)初設(shè)計(jì)融合蛋白時(shí)并沒(méi)有用間隔序列進(jìn)行連接，可能正是因?yàn)樗鼈兘嚯x的互斥強(qiáng)電荷影響了融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響空間結(jié)構(gòu)，使融合蛋白無(wú)法以二聚體形式存在，從而造成了融合基因雖在畢赤酵母中得到了正常表達(dá)，但無(wú)法發(fā)揮各自的正常功能。如果通過(guò)調(diào)換抗菌肽和干擾素的位置，并且在融合蛋白之間加入間隔序列可能會(huì)產(chǎn)生有活性的融合蛋白。

本研究通過(guò) SOE PCR合成融合基因 PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ基因，并成功在畢赤酵母中表達(dá)出融合蛋白PBD-2-PoIFNγ和PoIFNγ。雖然PBD-2與 PoIFNγ融合后的活性分析表明我們采用的融合方式并不能有效發(fā)揮它們之間的協(xié)同性，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深化對(duì)抗菌肽和干擾素融合蛋白研究提供了有益啟示，同時(shí)獲得的有活性的PoIFNγ也為大規(guī)模生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

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