蔡榮，葉昕

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

PHD finger protein 8蛋白多克隆抗體的制備、純化與檢測

蔡榮，葉昕

中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

PHD finger8 (PHF8) 蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一種帶有PHD結(jié)構(gòu)域和Jmjc結(jié)構(gòu)域的蛋白?，F(xiàn)有研究表明其可能在基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白去甲基化等方面發(fā)揮重要作用。為研究其功能，本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體pET41b-PHF8 (aa886-936)，在大腸桿菌Escherichia coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的PHF8 (aa886-936) 親水片段融合蛋白，并純化該片段作為抗原免疫家兔，再以CNBr活化Sepharose 4B微珠純化抗血清制備PHF8特異性多克隆抗體。Western blotting以及免疫熒光檢測表明該抗體具有很好的特異性，同時免疫熒光染色的結(jié)果也表明PHF8蛋白定位于細(xì)胞核。

PHF8，多克隆抗體，親和純化

1 材料與方法

1.1 材料

E. coli Top10、BL21菌株和HeLa細(xì)胞株由實驗室 保 存 ； pCMV-SPORT6-PHF8 質(zhì) 粒 購 于Openbiosystem。CNBr活化 Sepharose 4B微珠和Glutathione Sepharose 4B微珠購于GE Health公司；限制性內(nèi)切酶、Pyrobest酶、dNTPs購于TaKaRa公司；IPTG購于 Merck公司；多聚甲醛購于 Sigma公司。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建

在 GenBank查得此基因序列信息，用 BioEdit軟件分析其疏水性和抗原性，選取aa886-936這一段作為免疫家兔的抗原。以購買的 pCMV-SPORT6-PHF8載體為模板，用上游引物 (5′-cgGAATTCgcaaaa gaagaaatatatc-3′) 和下游引物 (5′-tacgGTCGACttcact caggaggaggcagggg-3′) PCR擴增 PHF8 (aa886-936)片段。擴增條件為：94℃ 1 min， 55℃ 45 s，72℃ 20 s，24個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后和pET41b載體分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切并回收。回收的載體和片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入E. coli Top10菌株。挑取的陽性克隆經(jīng)測序證實為所要的克隆。

1.3 抗原蛋白的表達(dá)與純化

將以上構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21菌株。用終濃度0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。離心收集菌體后用10倍菌體積的PBS將其重懸，在終濃度2 mmol/L PMSF下超聲裂解。裂解液經(jīng)12 000 × g，4℃離心10 min后取上清。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在 N端帶有 GST標(biāo)簽，可以用 Glutathione Sepharose 4B微珠親和純化。將適量 Glutathione Sepharose 4B微珠加入上清中，4℃結(jié)合4 h后，用10倍微珠體積的PBS洗去非特異性結(jié)合。洗過的微珠用100 mmol/L的谷胱甘肽4℃洗脫。洗脫下的蛋白用PBS透析后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測其純度和濃度，符合要求即可用于家兔的免疫。

1.4 兔抗PHF8蛋白抗體血清的制備

將上述抗原混入同等體積的弗氏完全佐劑免疫家兔。雌性家兔背部皮下取三點注射，每次免疫使用抗原0.5 mg，體積1 mL。每隔2周免疫1次，免疫3次后用間接ELISA法檢測抗血清效價。效價符合要求后按常規(guī)方法采集血清，血清中加入 0.01%的疊氮化鈉分裝，?20℃保存。

1.5 抗體親和純化

CNBr活化Sepharose 4B微珠各400 μL分別結(jié)合GST蛋白和GST-PHF8 (aa886-936) 融合蛋白形成共價偶聯(lián)。偶聯(lián)后的微珠用于后續(xù)的親和純化。

首先用Sepharose 4B-GST微珠除去抗血清中的GST抗體。400 μL微珠加入6 mL兔抗血清在純化柱中4℃孵育過夜，然后過柱子收集上清用于下一步純化。Sepharose 4B-GST柱子用100 mmol/L甘氨酸(pH 2.7) 洗脫GST抗體之后按說明書以高鹽緩沖液和低鹽緩沖液平衡。收集的上清再次通過平衡后的柱子以徹底除去血清中的GST抗體。

除去抗血清中的GST抗體后，再用CNBr活化的Sepharose 4B-GST-PHF8 (aa886-936) 微珠親和純化其中的PHF8抗體。室溫下將該上清 3次通過400 μL柱子，使其中的PHF8抗體與微珠上共價偶聯(lián)的抗原充分結(jié)合。然后 10倍體積 PBS過柱子 3次除去非特異性結(jié)合。再用3 mL pH 2.7的100 mmol/L甘氨酸洗脫PHF8抗體，600 μL分裝1管。最后用pH 8.0的Tris-HCl調(diào)pH至7.0，加入0.01%的疊氮化鈉4℃保存。

1.6 免疫印跡法檢測

取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pFLAG-CMV2-PHF8過表達(dá)FLAG-PHF8蛋白以及pFLAG-CMV2空載體的293T細(xì)胞裂解液和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 293T細(xì)胞裂解液SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜之后進行Western blotting實驗。實驗中，一抗為純化得到的抗體，二抗為帶辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體。

1.7 免疫熒光染色檢測

將 HeLa細(xì)胞置于玻片上，24 h后收樣，PBS洗過之后用4%多聚甲醛室溫固定10 min。固定后的細(xì)胞用1%TritonX-100 PBS打孔1 min，然后以10%山羊血清0.5%NP-40 PBS室溫封閉1 h。隨后一抗37℃室溫孵育1 h，熒光二抗避光室溫孵育1 h。最后DAPI染色后封片在熒光顯微鏡下觀察。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗原蛋白的制備

將構(gòu)建好的 pET41b-PHF8 (aa886-936) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21工程菌株，擴大化培養(yǎng)。菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后取樣進行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明該融合蛋白表達(dá)正常。將菌體超聲裂解后取上清，加入適量 Glutathione Sepharose 4B微珠進行親和純化，獲得純度較高的GST融合蛋白。獲得的蛋白溶液經(jīng)透析之后取5 μL樣進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測，結(jié)果表明已制得純度和濃度都較高的融合蛋白 (圖1)。

2.2 抗血清的獲得

將純化后的抗原加入等體積弗氏完全佐劑，免疫家兔。3次免疫之后血清采樣用于ELISA檢測。結(jié)果表明免疫 2只家兔獲得的抗血清效價均大于100 000，效價較高。

2.3 PHF8抗體親和純化

通過 GST-Sepharose 4B微珠除去抗血清中的GST抗體之后，結(jié)合在 Sepharose 4B微珠上的GST-PHF8 (aa886-936) 抗原特異性地和抗血清中的PHF8抗體相結(jié)合。用3 mL的pH 2.7的甘氨酸洗脫PHF8抗體，每600 μL分裝1管。每管分別取1 μL樣進行 SDS-PAGE電泳，并進行考馬斯亮藍(lán)染色(圖 2)。染色結(jié)果表明通過實驗得到了純度較高的PHF8抗體，其中第2管的純度和濃度都最高。

2.4 純化抗體的免疫印跡檢測

為檢測純化抗體的特異性，取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pFLAG-CMV2-PHF8過表達(dá)PHF8蛋白的293T細(xì)胞裂解液和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解液，用制得的抗體進行免疫印跡檢測。制得的抗體分別檢測到了內(nèi)源以及外源過表達(dá)的 PHF8蛋白，條帶清晰，表明抗體具有很好的特異性 (圖3)。

2.5 免疫熒光染色

將 HeLa細(xì)胞置于玻片上再轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pFLAGCMV2-PHF8，收樣后依照上述方法分別以 FLAG抗體和PHF8抗體為一抗進行免疫熒光染色分析。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 HeLa細(xì)胞也同樣固定進行了染色分析。結(jié)果顯示PHF8蛋白廣泛分布在細(xì)胞核中，并在某些區(qū)域形成致密的點狀結(jié)構(gòu) (圖 4)。PHF8抗體和FLAG抗體所得到的結(jié)果一致，而兔IgG染色未檢測到信號，也表明制得的抗體具有很好的特異性。

圖1 GST-PHF8 (aa886-936) 蛋白的純化Fig. 1 Purification of GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein. M: protein marker; 1: GST protein; 2: GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein; 3?9: BSA proteins, they were loaded in the order of 0.5 μg, 1.0 μg, 2.0 μg, 2.5 μg, 3.0 μg and 3.5 μg.

圖2 親和純化后的PHF8抗體Fig. 2 Affinity Purified PFH8 antibody. M: protein marker; 1?5: purified PHF8 antibody, elution 1 to 5; 6?9: BSA proteins were loaded in the order of 1 μg, 2 μg, 3 μg and 4 μg.

圖3 免疫印跡檢測293T細(xì)胞中的PHF8蛋白Fig. 3 Detection of PHF8 protein in 293T cells by Western blotting. 1: cell lysate from 293T cells transfected with pFLAG-CMV2-PHF8; 2: 293T cells transfected with pFLAG-CMV2; 3: 293T cell lysate.

圖4 純化的抗體以及FLAG抗體對PHF8的免疫熒光染色Fig. 4 Immunofluorescence of PHF8 protein in HeLa cells with purified antibody. 1: HeLa cells were transfected with pFLAG-CMV2-PHF8 and immunostained with FLAG antibody as a positive control; 2: HeLa cells were transfected with pFLAG-CMV2-PHF8 and immunostained with PHF8 antibody; 3: HeLa cells were immunostained with Rabbit IgG as a negative control; 4: HeLa cells were immunostained with PHF8 antibody. Nuclei were labeled with DAPI (blue).

3 討論

為研究 PHF8蛋白的功能，本實驗以免疫家兔獲得抗血清，再親和純化抗血清制備 PHF8多克隆抗體。實驗所選取的抗原具有較好的免疫原性和親水性，免疫家兔得到了效價較高的抗血清?？寡宓某煞直容^復(fù)雜，直接用于實驗往往非特異性信號較多而影響觀察。為得到高特異性的抗體，需要對抗血清中的抗體進行純化。

實驗室一般使用膜純化、柱純化或者分級沉淀[14]的方法進行親和純化。膜純化是較早出現(xiàn)的一種方法[15]，即將抗原通過SDS-PAGE電泳之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后使膜和抗血清充分結(jié)合使抗血清中的抗體和膜上的抗原在膜上形成復(fù)合物，再將結(jié)合到膜上的抗體洗脫下來。這種方法由于抗原量的限制，得到的抗體量較少，而且抗原也可能從硝酸纖維膜上洗脫下來摻入抗體之中，影響抗體的純度。柱純化因使用填料的種類也分為不同的類型。如使用A蛋白珠子[16]結(jié)合抗血清中的抗體進行初步的純化?；蛘呤褂?Sepharose微珠[17]結(jié)合抗原作為填料以增加抗體的特異性。但這種方法里微珠和抗原也是以氫鍵、疏水堆積等作用力結(jié)合，與抗原抗體結(jié)合作用力類似，因而對洗脫抗體的條件要求較苛刻，否則抗原依然會一起洗脫下來。柱純化的方法能制得大量的抗體，其難點在于提高抗體的純度。

本實驗中使用CNBr活化Sepharose 4B微珠[18]作為填料進行柱純化。抗原能和這種微珠形成穩(wěn)定的共價結(jié)合，因而不會隨抗體一起洗脫下來。這種方法不僅提高了抗原的純度，也能使抗體更徹底地洗脫下來，提高了抗體的總量。本實驗通過這種方法得到了大量 PHF8多克隆抗體，并用免疫印跡的方法驗證其特異性。用該抗體進行免疫熒光染色的結(jié)果則表明 PHF8蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。它在核內(nèi)有著廣泛的分布，并在某些地方形成致密的點狀結(jié)構(gòu)。制得高特異性抗體為 PHF8蛋白的功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Massagué J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature, 2004, 432(7015): 298–306.

[2] Geng Y, Lee YM, Welcker M, et al. Kinase-independent function of cyclin E. Mol Cell, 2007, 25(1): 127–139.

[3] Deng M, Li F, Ballif BA, et al. Identification and functional analysis of a novel cyclin e/cdk2 substrate ankrd17. J Biol Chem, 2009, 284(12): 7875–7888.

[4] Mariann Bienz. The PHD finger, a nuclear proteininteraction domain. Trends Biochem Sci, 2006, 31(1): 35–40.

[5] Musco G, Peterson P. PHD finger of autoimmune regulator: an epigenetic link between the histone modifications and tissue-specific antigen expression in thymus. Epigenetics, 2008, 3(6): 310–314.

[6] Shao Z, Zhang Y, Powell-Coffman JA. Two distinct roles for EGL-9 in the regulation of HIF-1-mediated gene expression in Caenorhabditis elegans. Genetics, 2009, 183(3): 821–829.

[7] Shimazaki N, Tsai AG, Lieber MR. H3K4me3 stimulates the V(D)J RAG complex for both nicking and hairpinning in trans in addition to tethering in cis: implications for translocations. Mol Cell, 2009, 34(5): 535–544.

[8] Sinha KM, Yasuda H, Coombes MM, et al. Regulation of the osteoblast-specific transcription factor Osterix by NO66, a Jumonji family histone demethylase. EMBO J, 2009, 29(1): 68–79.

[9] De Santa F, Narang V, Yap ZH, et al. Jmjd3 contributes to the control of gene expression in LPS-activated macrophages. EMBO J, 2009, 28(21): 3341–3352.

[10] Horton JR, Upadhyay AK, Qi HH, et al. Enzymatic and structural insights for substrate specificity of a family of jumonji histone lysine demethylases. Nat Struct Mol Biol, 2009, 17(1): 38–43.

[11] Abidi FE, Miano MG, Murray JC, et al. A novel mutation in the PHF8 gene is associated with X-linked mental retardation with cleft lip/cleft palate. Clin Genet, 2007, 72(1): 19–22.

[12] Koivisto AM, Ala-Mello S, Lemmel? S, et al. Screening of mutations in the PHF8 gene and identification of a novel mutation in a Finnish family with XLMR and cleft lip/cleft palate. Clin Genet, 2007, 72(2): 145–149.

[13] Loenarz C, Ge W, Coleman ML, et al. PHF8, a gene associated with cleft lip/palate and mental retardation, encodes for an Nepsilon-dimethyl lysine demethylase. Hum Mol Genet, 2010, 19(2): 217–222.

[14] Wang Z, Dai R, Zhang JW, et al. Induced expression of Arabidopsis thaliana WUSCHEL in Escherichia coli, affinity protein purification and polyclonal antibody preparation. Chin J Biotech, 2009, 25(9): 1409–1416.王增, 代茹, 張江巍, 等. 擬南芥WUSCHEL 蛋白的原核表達(dá)、親和純化和多克隆抗體制備. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(9): 1409–1416.

[15] Zhang WH, Liu XP, Wang JC, et al. Preparation, purificatioin and idetification of rabbit antiserum against human NDR2 protein. J Fourth Mil Med Univ, 2002, 23(8): 716.張文紅, 劉新平, 王吉村, 等. 兔抗人 NDR2高效價抗血清的制備、純化及鑒定. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2002, 23(8): 716.

[16] He L, Lao FX, Liu ZH, et al. The expression of the recombinant human FS315 terminal peptide and preparation of its antibody. Chin Biotech, 2005, 5(8): 56.何莉, 勞鳳學(xué), 柳忠輝, 等. 重組 FS315 C末端蛋白的表達(dá)及其抗體的制備. 中國生物工程雜志, 2005, 5(8): 56.

[17] Shu W, Li FH, Deng M, et al. Preparation, purification the antibody and immunofluorescence analyse of ANKRD17. Lett Biotech, 2007, 18(5): 771–772.舒?zhèn)? 李發(fā)慧, 鄧敏, 等. Ankrd17蛋白抗體的制備、純化及檢測. 生物技術(shù)通訊, 2007, 18(5): 771–772.

[18] Jia L, Shi ZY, Zhang JL. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of TRαA in Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Chin J Biotech, 2009, 25(7): 999–1006.賈亮, 施志儀, 張俊玲. 牙鲆甲狀腺激素受體 TRαA 的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(7): 999–1006.

Preparation, purification and identification of the polyclonal antibody of PHD finger protein 8

Rong Cai, and Xin Ye
Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

PHD finger protein 8 (PHF8) is a novel protein with PHD domain and Jmjc domain, which may play important role in regulating transcription and histone demethylation. It is necessary to generate the antibody against PHF8 in order to further study its biological function. First we constructed plasmid pET41b-PHF8 (aa886-936) and expressed the GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein in Escherichia coli BL21. We then purified the fusion protein by Glutathione Sepharose 4B beads and subjected to immunize the rabbits for acquiring antiserum. We obtained PHF8 polyclonal antibody by affinity purifying the antiserum with CNBr-activated Sepharose 4B beads. The antibody was effective in Western blotting and immunofluorescence with high specificity. Immunofluorescence also showed that PHF8 protein was located in nucleus in HeLa cells.

PHF8, polyclonal antibody, affinity purification

為維持生物體正常的結(jié)構(gòu)與功能，細(xì)胞分裂以一個周期的形式有序進行。多種蛋白參與這一過程的調(diào)控，以維持細(xì)胞周期的正常穩(wěn)定。Cdk2 (細(xì)胞周期素依賴激酶2) 在G1期到S期的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。它與細(xì)胞周期素Cyclin E結(jié)合，通過磷酸化下游一系列底物如Rb、NPAT、Cdc6等，啟動DNA的合成，使細(xì)胞不可逆地進入S期[2]。前期的工作表明PHD finger 8 (PHF8)蛋白和Cdk2存在相互作用[3]。PHF8是最新發(fā)現(xiàn)的含有 PHD[4-7]和Jmjc[8-10]結(jié)構(gòu)域的蛋白。目前的研究表明這兩個結(jié)構(gòu)域的功能和組蛋白去甲基化以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。目前在神經(jīng)發(fā)育遲緩病例中發(fā)現(xiàn)其多種突變體的存在[11-12]，最新研究發(fā)現(xiàn)其具有去甲基化的功能[13]。為了研究 PHF8蛋白在細(xì)胞中的定位，也為進一步功能研究奠定基礎(chǔ)，本實驗制備了 GST-PHF8 (aa886-936) 融合蛋白作為抗原免疫家兔獲取抗血清，并通過CNBr活化Sepharose 4B微珠親和純化抗血清得到了 PHF8特異性多克隆抗體。該抗體用于PHF8蛋白的Western blotting檢測以及在HeLa細(xì)胞的免疫熒光染色。

November 2, 2009; Accepted: January 7, 2010

Supported by:National Nature Science Foundation of China (No. 30771098).

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