亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        嵌合表皮生長因子疫苗E5T-mSEA的設(shè)計及抑瘤活性檢測

        2010-02-09 09:33:52尹晴晴賈海威張艷紅劉傳暄馬清鈞張部昌鐘輝胥全彬
        生物工程學(xué)報 2010年3期
        關(guān)鍵詞:小鼠血清融合

        尹晴晴,賈海威,張艷紅,劉傳暄,馬清鈞,張部昌,鐘輝,胥全彬

        1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,合肥 230039

        2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850

        3 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院,北京 100048

        EGFR在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),這種高水平表達(dá)與腫瘤進(jìn)行到晚期密切相關(guān)[1]。腫瘤細(xì)胞以自分泌循環(huán)的方式通過EGFR與其配體 (EGF、TGFα) 結(jié)合,在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[2-4]。阻斷這種相互作用,便成為抗EGFR高表達(dá)腫瘤藥物的重要研究方向。目前,已經(jīng)進(jìn)入市場的EGFR靶向藥物主要有兩類:一類是 EGFR的拮抗劑,包括小分子藥物(Gefitinib、Erlotinib及 Lapatinib) 和單抗藥物(Cetuximab、Panitumumab及Trastuzumab);另一類是針對EGF的治療性亞單位疫苗,如CimaVax EGF。由于現(xiàn)有小分子化合物藥物大多有較強(qiáng)的毒副作用,如導(dǎo)致肝毒性、皮膚出現(xiàn)丘膿皰性潰瘍等[5],因此,發(fā)展以EGFR為靶標(biāo)的高效、低毒的抗癌藥物依然是抗癌藥物的研究重點。EGF抗腫瘤疫苗CimaVax EGF正是這樣的抗癌藥物,它僅會使患者的注射部位出現(xiàn)輕微的紅斑和瘙癢癥狀。該疫苗已經(jīng)于2009年4月在古巴進(jìn)入市場,呈現(xiàn)很好的應(yīng)用前景,而TGFα疫苗目前也正處于臨床前研究階段。

        為了開發(fā)出能夠同時針對 TGFα和 EGF的疫苗,設(shè)計了一個由TGFα、EGF組成的50個氨基酸的嵌合分子,該分子包含了與EGFR結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域。由于E5T與EGFR天然配體的同源性較高導(dǎo)致其免疫原性較低,如果直接免疫其抗體效價很可能不會太高。為了增強(qiáng) E5T的免疫原性,本研究沒有采用傳統(tǒng)的載體蛋白,而是將具有免疫增強(qiáng)作用的金黃色葡萄球菌腸毒素A (Staphylococcus enterotoxin A,SEA) 與之融合。初步研究結(jié)果表明:SEA能夠明顯增強(qiáng)E5T的免疫原性,免疫小鼠能夠同時產(chǎn)生針對TGFα和EGF的抗體;將此蛋白抗血清與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng),能顯著抑制EGFR陽性細(xì)胞A431的生長。因此,E5T-mSEA有可能被進(jìn)一步發(fā)展成為針對EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的新型治療性疫苗。

        1 材料和方法

        1.1 實驗材料

        人源腫瘤細(xì)胞表皮鱗癌 A431細(xì)胞及胚腎細(xì)胞293T 均為本室保存;細(xì)胞培養(yǎng)基 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 購自 Gibco公司;胎牛血清 (FCS) 購自杭州四季青生物制品公司;青霉素、鏈霉素等抗生素均購自 Gibco公司;牛血清白蛋白 (BSA)、胰酶等為Sigma 公司生產(chǎn);C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。

        1.2 方法

        1.2.1 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

        利用PCR分別以EGF和pET-TGFα3-mSEA為模板,擴(kuò)增出 E5T,具體步驟為:先分別用 P1/P2和P3/P4引物擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為94℃ 10 s;94℃ 10 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s,30個循環(huán);最后72 ℃ 2 min 。然后將兩擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合,94℃ 10 s變性后,加入1 μL Pfu酶,72℃保溫30 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物,目的擴(kuò)增片段預(yù)期大小為147 bp。膠回收的PCR產(chǎn)物,用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后,插入經(jīng)相同酶切處理的質(zhì)粒載體 pETTGFα3-mSEA中,構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-E5T-mSEA。重疊 PCR所用的引物為:P1:5′-CTCATATG A ATTCCGACTCTGAATG-3′;P2:5′-TGGCACACGCA CGCGTATTTTGTC-3′;P3:5′-CAAATACGCGTGCG TGTGCCATTCTG-3′;P4:5′-AACTCGAG GGCCAGG AGG TCCGCATG-3。下劃線所示為添加的酶切位點部分。

        1.2.2 融合蛋白的制備

        重組SEA蛋白的純化步驟,基本參照胥全彬等的方法[6],并略有修改。將 pET-E5T-mSEA 轉(zhuǎn)化BL-21(DE3),低溫誘導(dǎo)制備融合蛋白的可溶表達(dá)上清,過濾后4℃保存。裝好 Chelating Sepharose 柱,按常規(guī)上 Ni2+、平衡層析柱,上樣品,用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl) 平衡至基線后,用洗脫液 (20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,80 mmol/L咪唑,pH 6.0) 洗脫,收集洗脫峰,將含目標(biāo)蛋白的洗脫組分進(jìn)行濃縮、除鹽,并對純度進(jìn)行分析。

        SDS-PAGE中蛋白相對含量的確定在天能 GIS凝膠圖象處理系統(tǒng)中完成。純化蛋白濃度的測定按BCA Protein Assay Kit (Pierce) 說明進(jìn)行。

        1.2.3 抗融合蛋白抗體的制備、效價測定及純化

        將5周的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4個組 (E5T-mSEA、rSEA、E5T陽性對照和生理鹽水陰性對照),每組10只。免疫前采血,然后分別以10 μg蛋白連續(xù)免疫4次,每次間隔10 d;免疫前均采集小鼠尾血,檢測血清效價。

        用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至合適濃度,每孔包被100 μL,具體如下:1) 測定抗E5T-mSEA抗體:用500 ng/0.1 mL E5T-mSEA包被,以1:400稀釋抗體;2) 測定抗rSEA抗體:用500 ng/0.1 mL rSEA包被,以1:400稀釋抗體;3) 測定抗E5T抗體:用500 ng/0.1 mL TGFα、EGF包被,以1:50稀釋抗體;4) 測定抗融合蛋白抗體中E5T抗體:用500 ng/ 0.1 mL EGF、TGF包被,以1:50稀釋抗E5T-mSEA抗體;同時以相同倍數(shù)稀釋抗rSEA抗體及陰性血清對照。

        4℃過夜;PBST洗5次,每次2 min;用含1% BSA的封閉液37℃封閉1 h;將陽性及陰性血清進(jìn)行倍比稀釋 (具體倍數(shù)見后) ,每個稀釋度每孔加入100 μL,37℃孵育1 h;PBST洗5次,每次2 min;然后加入1:5000 HRP標(biāo)記的酶標(biāo)二抗,37℃孵育1 h;PBST洗5次,每次2 min;加入新鮮配置的OPD顯色液100 μL,顯色5 min后,用20 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng),OD495測光密度。各步相應(yīng)設(shè)置一抗、二抗及空白對照??贵w效價判定依據(jù):

        (P:陽性血清光密度;N:陰性血清光密度)

        1.2.4 免疫印跡試驗

        將 A431或 293T細(xì)胞可溶裂解蛋白按常規(guī)SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上;將轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜用 10 mL 5%脫脂牛奶在脫色搖床上室溫封閉1 h,然后用PBST洗3次,每次15 min。加入1:1000 稀釋EGFR抗體 (Santa cruz)或β-actin 抗體 (Santa cruz),室溫孵育1 h。PBST洗液漂洗3次后,再加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記二抗,室溫孵育1 h。隨后步驟按常規(guī)操作進(jìn)行。

        1.2.5 抗融合蛋白抗體對腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

        將A431細(xì)胞或293T細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板,過夜培養(yǎng)后分別加入不同稀釋度的抗E5T-mSEA或抗rSEA免疫血清。37℃培養(yǎng)24 h后,相差顯微鏡下拍照,并按常規(guī)MTT法對活細(xì)胞進(jìn)行測定。

        2 結(jié)果

        2.1 融合蛋白的表達(dá)與制備

        本實驗所設(shè)計的融合蛋白由E5T和SEA兩部分組成,為了避免融合對SEA構(gòu)象的影響,兩者之間添加了8個氨基酸的柔性連接序列 (GGGS)2為:MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYA CVCHSGYVGARCEHADLLA-GGSGSGGG-SE KSEEINEKDLRKKSELQGTALGNLKQIYYYN EKAKTENKESHDQFLQHTILFKGFFTDHSWY NDLLVDFDSKDIVDKYKGKKVDLYGAYYGYQ CAGGTPNKTACMYGGVTLHDNNRLTEEKKVP INLWLDGKQNTVPLETVKTNKKNVTVQELDL QARRYLQEKYNLYNSDVFDGKVQRGLIVFHT STEPSVNYDLFGAQGQYSNTLLRIYRDNKTI NSENMHIDIYLYTSLEHHHHHH

        將重組質(zhì)粒 pET-E5T-mSEA轉(zhuǎn)化 BL-21(DE3)宿主菌,獲得工程菌 BL-21(DE3,pET-E5T-mSEA),用1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行低溫誘導(dǎo),可以使此融合蛋白高效表達(dá) (圖1A)。將低溫誘導(dǎo)的可溶性蛋白通過金屬螯合親和層析進(jìn)行純化,純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離、考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的融合蛋白有2條帶,主要條帶與預(yù)期的分子量相符,為34 kDa,另外一條則約為70 kDa (圖1B)。本實驗小組的前期研究發(fā)現(xiàn)純化的SEA在SDS-PAGE電泳后,仍有部分蛋白以二聚體形式存在 (另文發(fā)表)。因此70 kDa處的蛋白至少部分是因SEA二聚化而形成的E5T-mSEA二聚體。

        2.2 抗融合蛋白血清的效價測定

        將E5T-mSEA、rSEA及E5T免疫小鼠,結(jié)果表明所有E5T-mSEA、rSEA免疫組小鼠均產(chǎn)生了高滴度抗體 (圖 2),用相應(yīng)蛋白包被檢測其效價,結(jié)果均在1:60 000以上;用TGFα及EGF包被檢測兩組血清樣品,結(jié)果在E5T-mSEA血清樣品中檢測到了針對TGFα和EGF的抗體,針對 TGFα的抗體效價為1:16 000,針對EGF的抗體效價為1:32 000。而所有E5T免疫組小鼠的血清,ELISA檢測為陰性。E5T與小鼠的TGFα和EGF均有較高的同源性,在本實驗條件下直接免疫小鼠所產(chǎn)生的抗體滴度很低,而與SEA融合后,可顯著提高抗體滴度,這表明SEA具有較強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)。

        2.3 抗融合蛋白抗體能夠?qū)GFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用

        為了分析融合蛋白抗血清能否抑制EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的生長,首先對試驗細(xì)胞的EGFR的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,在A431細(xì)胞中EGFR是高表達(dá)的,而在 293T細(xì)胞中則沒有 EGFR表達(dá)(圖3A)。

        圖1 E5T-SEA融合蛋白的表達(dá)和純化Fig. 1 Expression and purification of E5T-SEA fusion protein in E. coli. (A) BL21(DE3) with pET-E5T-mSEA was induced with 1 mmol/L IPTG(lane 1), BL21(DE3) with pET-E5T-mSEA without induction (lane 2), BL21(DE3) with pET-22b(+) (lane 3), protein marker (lane 4). (B) Purified E5T-mSEA(lane 1), protein marker (lane 2).

        圖2 免疫小鼠血清效價的測定Fig. 2 Detection of antibodies titers of serum from immunized mice. 40 mice were randomized into four groups and immunized with E5T-mSEA, rSEA, E5T or adjuvant only. To detect the titers of antibody against E5T-mSEA in serum of E5T-mSEA immunized mice, the E5T-mSEA were coated and corresponding serum were applied sequentially. To detect other antibodies against other interest proteins, the proteins and serum were applied in the same way as E5T-mSEA (serum from applied protein/coated protein).

        圖3 E5T-mSEA抗血清能顯著抑制EGF/TGFα/EGFR依賴性腫瘤細(xì)胞的生長Fig. 3 E5T-mSEA anti-serum can inhibit the growth of EGF/ TGFα/EGFR dependent tumor cell lines significantly. (A) The expression level of EGFR in different tumor cell lines. E5T-mSEA anti-serum can inhibit the growth of EGF/TGFα/ EGFR dependent tumor A431 significantly (B, D). But has no effect on EGFR negative cell 293T(C, D). In figure B and C, ET means dilution ratio of E5T-mSEA anti-serum.

        向293T 和A431細(xì)胞中分別加入不同稀釋度的抗E5T-mSEA或抗rSEA (陰性對照) 免疫血清培養(yǎng)24 h后,抗E5T-mSEA免疫血清幾乎可以將A431腫瘤細(xì)胞完全殺死,而對293T細(xì)胞的生長沒有明顯的影響,死亡率小于5% (圖3B、C)。表明抗E5T-mSEA免疫血清只對EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有抑制作用。

        3 討論

        腫瘤患者機(jī)體免疫處于抑制狀態(tài)[7],腫瘤抗原在機(jī)體內(nèi)免疫原性下降,造成特異性細(xì)胞免疫激活不足,外周免疫耐受的狀況。因此,腫瘤疫苗設(shè)計策略的總體思路是應(yīng)用各種技術(shù),增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別能力,改善免疫微環(huán)境,引發(fā)有力的特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫,阻止腫瘤進(jìn)展,最終消除腫瘤[8-9]。葡萄球菌腸毒素 A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA) 是金黃葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素之一,為sea基因編碼的257個氨基酸組成的多肽,是一種細(xì)菌超抗原,在極低劑量時即可直接與抗原提呈細(xì)胞 (Antigen presenting cell,APC) MHC II類分子和T細(xì)胞抗原識別受體 (T cell receptor,TCR)特異地結(jié)合,誘導(dǎo)T淋巴母細(xì)胞有絲分裂并促進(jìn)T細(xì)胞釋放IL-I、IL-2和TNF-7等多種細(xì)胞因子,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-12]。研究報道將牛血清白蛋白BSA及HIV的gp160分別免疫小鼠,隨后再用SEA注射小鼠,發(fā)現(xiàn)由于超抗原的激活作用使針對胸腺依賴性抗原BSA、gp160的抗體滴度分別增加了3~4倍[13]。這項研究提示利用超抗原SEA來打破對同源蛋白的免疫耐受完全可能。目前,利用超抗原的免疫激活效應(yīng)來提高抗腫瘤抗原的免疫性已有成功應(yīng)用。比如,將SEA加上疏水的跨膜區(qū)域 (Transmembrane domain,TM) 尾巴以后用來修飾腫瘤衍生的exosome,定位于exosome的表面,形成Exo/SEA-TM,可以誘導(dǎo)腫瘤特異的cytotoxic T lymphocyte (CTL),對腫瘤的生長具有明顯的抑制作用[14]。目前,還未見以其為佐劑進(jìn)行腫瘤疫苗的研究,本實驗對此進(jìn)行了初步的嘗試。

        本實驗所構(gòu)建的E5T是EGF和TGFα的嵌合分子,其空間構(gòu)象與 TGFα、EGF的構(gòu)象非常相似,尤其是EGF (圖4),推測其免疫原性可能會比較低,本實驗結(jié)果也證實了這一點,即直接以E5T免疫小鼠并不能產(chǎn)生高效價抗體 (圖2)。本研究以SEA作為E5T的載體蛋白,則能有效激活腫瘤攜帶體的免疫系統(tǒng),打破E5T的同源耐受。實驗結(jié)果表明,融合蛋白E5T-mSEA免疫小鼠后可以產(chǎn)生高滴度的抗體,在E5T-mSEA中均檢測到了針對TGFα和EGF的抗體,針對TGFα效價為1:16 000,針對EGF的抗體為1:32 000 (圖2)。這提示將SEA作為載體蛋白能夠有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對E5T的抗體。

        由于將佐劑與抗原分別注射進(jìn)行免疫給實際應(yīng)用帶來一定不便,將超抗原與靶抗原融合則使其臨床的可能性大為增加。由于SEA只能以完整分子的形式被MHC分子遞呈給T細(xì)胞,才能啟動增強(qiáng)免疫系統(tǒng)識別能力的反應(yīng);另一方面,維持 E5T的構(gòu)象也有利于E5T表位 (線性表位和空間表位) 的完整性。因此,在將靶抗原與SEA進(jìn)行融合時,為了保證兩者空間構(gòu)象的完整性,在兩者之間添加了一個通用的8氨基酸連接肽 (GGGS)2,該肽已經(jīng)被證實能夠很好地保持融合蛋白己酮糖磷酸合成酶 (Hexulose phosphate synthase,HPS) (23 kDa) -GFP(27 kDa) 各自的構(gòu)象[15]。

        圖4 E5T表位嵌合分子保持了與EGF和TGFα相似的空間構(gòu)象Fig. 4 The E5T shows similar conformation with that of EGF and TGFα.

        本研究對以SEA為載體的EGFR配體疫苗進(jìn)行了探索,初步結(jié)果令人振奮。但有很多問題需要回答,如SEA是否能激活E5T特異性CD4+T細(xì)胞以及是否優(yōu)于現(xiàn)有的其他載體蛋白;盡管抗E5T包含了與EGFR結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域,抗E5T-SEA血清能識別EGF和TGFα,也能夠顯著抑制EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的生長,但由于 A431細(xì)胞的生長是依賴于EGF、TGFα之一還是同時依賴于兩者目前并不清楚。因而,E5T嵌合蛋白抗體對 EGF/EGFR、TGFα/EGFR相互作用的阻斷效率也不清楚。上述問題,有待后續(xù)研究中進(jìn)一步展開。

        感謝:感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所曹誠教授和靳彥文博士提供有益的建議,感謝本實驗室其他同志的支持和幫助。

        REFERENCES

        [1] Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signaling network. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2: 127?137.

        [2] Gamett DC, Pearson G, Cerione RA, et al. Sondary dimerization between members of the epidermal growth factor receptor family. J Biol Chem, 1997, 272(18): 12052–12056.

        [3] Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, et al. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol, 1995, 19: 183?232.

        [4] Sartor CI. Biological modifiers as potential radiosensitizers: targeting the epidermal growth factor receptor family. Semin Oncol, 2000, 27(suppl 11): 15?20.

        [5] Widakowich C, de-Castro-G Jr, de-Azambuja E, et al. Side effects of approved molecular targeted therapies in solid cancers. The Oncologist, 2007, 12: 1443–1455.

        [6] Xu QB, Liu CX, Ma QJ. The expression and activity essay of Staphylococcus enterotoxin A. Chin J Biotech, 2003, 19(4): 402?406.胥全彬, 劉傳暄, 馬清鈞. 金黃色葡萄球菌腸毒素A的基因克隆、表達(dá)及活性試驗. 生物工程學(xué)報, 2003, 19(4): 402?406.

        [7] Ding HX. The mechanism of tumor immunity escape. Strait Pharmaceutical J, 2008, 20(7): 12?14.丁紅仙. 腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究進(jìn)展. 海峽藥學(xué), 2008, 20 (7): 12?14.

        [8] Ouyang Q, Wei YY, Jin BQ, et al. The mechanism and research progression about tumor vaccine. J Fourth Mil Med Univ, 2008, 29(19): 1820?1823.歐陽清, 魏玉英, 金伯泉, 等. 腫瘤疫苗的作用機(jī)制及研究進(jìn)展. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2008, 29(9): 1820?1823.

        [9] Du J, Qian XP, Liu BR. A review of clinical trials for cancer vaccine. Modern Oncology, 2009, 17(1): 161?165.杜娟, 錢曉萍, 劉寶瑞. 腫瘤疫苗的臨床研究進(jìn)展. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2009, 17(1): 161?165.

        [10] Torres BA, Perrin GQ, Mujtaba MG, et al. Superantigen enhancement of specific immunity: antibody production and signaling pathways. J Immunol, 2002, 69(6): 2907?2914.

        [11] Yu JY, Tian R, Xiu BS, et al. Antitumor activity of T cells generated from lymph nodes draining the SEA-expression murine B16 malanoma and sondarily activated with dendritic cells. Int J Biol Sci, 2009, 5(2): 135?146.

        [12] Xu QB, Zhang YH, Zhang LL, et al. Growth inhibition of tumor by recombinant SEA. Chin J Can Biother, 2005, 12(2): 103?106.胥全彬, 張艷紅, 張雷雷, 等. 重組金葡菌腸毒素 A的抗癌效應(yīng)研究. 中國腫瘤生物治療雜志, 2005, 12(2): l03?106.

        [13] Alan Wells. Molecules in focus: EGF receptor. Int J Biochem Cell Boil, 1999, 31: 637?643.

        [14] Xiu FM, Cai ZJ, Yang YS, et al. Surface anchorage of superantigen SEA promotes induction of specific antitumor immune response by tumor-derived exosomes. J Mol Med, 2007, 85: 511?521.

        [15] Cabantous S, Terwilliger TC, Waldo GS. Protein tagging and deletion with engineered self-assemblying fragments of green fluorescent protein. Nat Biol, 2004, 23: 102?107.

        猜你喜歡
        小鼠血清融合
        村企黨建聯(lián)建融合共贏
        血清免疫球蛋白測定的臨床意義
        中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
        融合菜
        Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例
        從創(chuàng)新出發(fā),與高考數(shù)列相遇、融合
        慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達(dá)及其臨床意義
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        《融合》
        米小鼠和它的伙伴們
        加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
        亚洲妇女无套内射精| 日本高清在线播放一区二区| 日本视频一中文有码中文| 又粗又黄又猛又爽大片app| 欧美性xxxx狂欢老少配| 极品诱惑一区二区三区| 少妇人妻精品一区二区三区视 | 精品久久久中文字幕人妻| 国产亚洲欧美精品一区| 国产免费一区二区三区三| 亚洲第一女人av| 成 人 免费 黄 色 视频| 亚洲av成人精品日韩在线播放| 亚洲国产人在线播放首页 | 亚洲国产成人av二区| 日韩人妻无码精品-专区| 国模精品二区| 性色av一区二区三区密臀av | 伊人狼人激情综合影院| 一本色道久久亚洲av红楼| 国产七十六+老熟妇| 国产精品内射后入合集| 欧美综合自拍亚洲综合百度| 成年网站在线91九色| 日韩精品极品视频在线观看免费| 日韩精品大片在线观看| 中文字幕成人精品久久不卡| 国产桃色一区二区三区| 国产精品亚洲欧美大片在线看 | 1精品啪国产在线观看免费牛牛| 久久精品国产亚洲av专区| 国产无套乱子伦精彩是白视频| 国产成人久久精品77777综合| 亚洲成AV人久久| 日本大片在线一区二区三区| 职场出轨的人妻中文字幕| 性生交大全免费看| 成人在线免费视频亚洲| 日本师生三片在线观看| 不卡一卡二卡三乱码免费网站| 亚洲自拍另类制服在线|