尹晴晴，賈海威，張艷紅，劉傳暄，馬清鈞，張部昌，鐘輝，胥全彬

1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230039

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

3 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100048

EGFR在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，這種高水平表達(dá)與腫瘤進(jìn)行到晚期密切相關(guān)[1]。腫瘤細(xì)胞以自分泌循環(huán)的方式通過EGFR與其配體 (EGF、TGFα) 結(jié)合，在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[2-4]。阻斷這種相互作用，便成為抗EGFR高表達(dá)腫瘤藥物的重要研究方向。目前，已經(jīng)進(jìn)入市場的EGFR靶向藥物主要有兩類：一類是 EGFR的拮抗劑，包括小分子藥物(Gefitinib、Erlotinib及 Lapatinib) 和單抗藥物(Cetuximab、Panitumumab及Trastuzumab)；另一類是針對EGF的治療性亞單位疫苗，如CimaVax EGF。由于現(xiàn)有小分子化合物藥物大多有較強(qiáng)的毒副作用，如導(dǎo)致肝毒性、皮膚出現(xiàn)丘膿皰性潰瘍等[5]，因此，發(fā)展以EGFR為靶標(biāo)的高效、低毒的抗癌藥物依然是抗癌藥物的研究重點。EGF抗腫瘤疫苗CimaVax EGF正是這樣的抗癌藥物，它僅會使患者的注射部位出現(xiàn)輕微的紅斑和瘙癢癥狀。該疫苗已經(jīng)于2009年4月在古巴進(jìn)入市場，呈現(xiàn)很好的應(yīng)用前景，而TGFα疫苗目前也正處于臨床前研究階段。

為了開發(fā)出能夠同時針對 TGFα和 EGF的疫苗，設(shè)計了一個由TGFα、EGF組成的50個氨基酸的嵌合分子，該分子包含了與EGFR結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域。由于E5T與EGFR天然配體的同源性較高導(dǎo)致其免疫原性較低，如果直接免疫其抗體效價很可能不會太高。為了增強(qiáng) E5T的免疫原性，本研究沒有采用傳統(tǒng)的載體蛋白，而是將具有免疫增強(qiáng)作用的金黃色葡萄球菌腸毒素A (Staphylococcus enterotoxin A，SEA) 與之融合。初步研究結(jié)果表明：SEA能夠明顯增強(qiáng)E5T的免疫原性，免疫小鼠能夠同時產(chǎn)生針對TGFα和EGF的抗體；將此蛋白抗血清與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，能顯著抑制EGFR陽性細(xì)胞A431的生長。因此，E5T-mSEA有可能被進(jìn)一步發(fā)展成為針對EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的新型治療性疫苗。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人源腫瘤細(xì)胞表皮鱗癌 A431細(xì)胞及胚腎細(xì)胞293T 均為本室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 購自 Gibco公司；胎牛血清 (FCS) 購自杭州四季青生物制品公司；青霉素、鏈霉素等抗生素均購自 Gibco公司；牛血清白蛋白 (BSA)、胰酶等為Sigma 公司生產(chǎn)；C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PCR分別以EGF和pET-TGFα3-mSEA為模板，擴(kuò)增出 E5T，具體步驟為：先分別用 P1/P2和P3/P4引物擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃ 10 s；94℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃ 2 min 。然后將兩擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，94℃ 10 s變性后，加入1 μL Pfu酶，72℃保溫30 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物，目的擴(kuò)增片段預(yù)期大小為147 bp。膠回收的PCR產(chǎn)物，用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后，插入經(jīng)相同酶切處理的質(zhì)粒載體 pETTGFα3-mSEA中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-E5T-mSEA。重疊 PCR所用的引物為：P1:5′-CTCATATG A ATTCCGACTCTGAATG-3′；P2:5′-TGGCACACGCA CGCGTATTTTGTC-3′；P3:5′-CAAATACGCGTGCG TGTGCCATTCTG-3′；P4:5′-AACTCGAG GGCCAGG AGG TCCGCATG-3。下劃線所示為添加的酶切位點部分。

1.2.2 融合蛋白的制備

重組SEA蛋白的純化步驟，基本參照胥全彬等的方法[6]，并略有修改。將 pET-E5T-mSEA 轉(zhuǎn)化BL-21(DE3)，低溫誘導(dǎo)制備融合蛋白的可溶表達(dá)上清，過濾后4℃保存。裝好 Chelating Sepharose 柱，按常規(guī)上 Ni2+、平衡層析柱，上樣品，用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl) 平衡至基線后，用洗脫液 (20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，80 mmol/L咪唑，pH 6.0) 洗脫，收集洗脫峰，將含目標(biāo)蛋白的洗脫組分進(jìn)行濃縮、除鹽，并對純度進(jìn)行分析。

SDS-PAGE中蛋白相對含量的確定在天能 GIS凝膠圖象處理系統(tǒng)中完成。純化蛋白濃度的測定按BCA Protein Assay Kit (Pierce) 說明進(jìn)行。

1.2.3 抗融合蛋白抗體的制備、效價測定及純化

將5周的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4個組 (E5T-mSEA、rSEA、E5T陽性對照和生理鹽水陰性對照)，每組10只。免疫前采血，然后分別以10 μg蛋白連續(xù)免疫4次，每次間隔10 d；免疫前均采集小鼠尾血，檢測血清效價。

用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至合適濃度，每孔包被100 μL，具體如下:1) 測定抗E5T-mSEA抗體：用500 ng/0.1 mL E5T-mSEA包被，以1:400稀釋抗體；2) 測定抗rSEA抗體：用500 ng/0.1 mL rSEA包被，以1:400稀釋抗體；3) 測定抗E5T抗體：用500 ng/0.1 mL TGFα、EGF包被，以1:50稀釋抗體；4) 測定抗融合蛋白抗體中E5T抗體：用500 ng/ 0.1 mL EGF、TGF包被，以1:50稀釋抗E5T-mSEA抗體；同時以相同倍數(shù)稀釋抗rSEA抗體及陰性血清對照。

4℃過夜；PBST洗5次，每次2 min；用含1% BSA的封閉液37℃封閉1 h；將陽性及陰性血清進(jìn)行倍比稀釋 (具體倍數(shù)見后) ，每個稀釋度每孔加入100 μL，37℃孵育1 h；PBST洗5次，每次2 min；然后加入1:5000 HRP標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h；PBST洗5次，每次2 min；加入新鮮配置的OPD顯色液100 μL，顯色5 min后，用20 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，OD495測光密度。各步相應(yīng)設(shè)置一抗、二抗及空白對照?？贵w效價判定依據(jù)：

(P：陽性血清光密度；N：陰性血清光密度)

1.2.4 免疫印跡試驗

將 A431或 293T細(xì)胞可溶裂解蛋白按常規(guī)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；將轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜用 10 mL 5%脫脂牛奶在脫色搖床上室溫封閉1 h，然后用PBST洗3次，每次15 min。加入1:1000 稀釋EGFR抗體 (Santa cruz)或β-actin 抗體 (Santa cruz)，室溫孵育1 h。PBST洗液漂洗3次后，再加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。隨后步驟按常規(guī)操作進(jìn)行。

1.2.5 抗融合蛋白抗體對腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

將A431細(xì)胞或293T細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板，過夜培養(yǎng)后分別加入不同稀釋度的抗E5T-mSEA或抗rSEA免疫血清。37℃培養(yǎng)24 h后，相差顯微鏡下拍照，并按常規(guī)MTT法對活細(xì)胞進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的表達(dá)與制備

本實驗所設(shè)計的融合蛋白由E5T和SEA兩部分組成，為了避免融合對SEA構(gòu)象的影響，兩者之間添加了8個氨基酸的柔性連接序列 (GGGS)2為：MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYA CVCHSGYVGARCEHADLLA-GGSGSGGG-SE KSEEINEKDLRKKSELQGTALGNLKQIYYYN EKAKTENKESHDQFLQHTILFKGFFTDHSWY NDLLVDFDSKDIVDKYKGKKVDLYGAYYGYQ CAGGTPNKTACMYGGVTLHDNNRLTEEKKVP INLWLDGKQNTVPLETVKTNKKNVTVQELDL QARRYLQEKYNLYNSDVFDGKVQRGLIVFHT STEPSVNYDLFGAQGQYSNTLLRIYRDNKTI NSENMHIDIYLYTSLEHHHHHH

將重組質(zhì)粒 pET-E5T-mSEA轉(zhuǎn)化 BL-21(DE3)宿主菌，獲得工程菌 BL-21(DE3，pET-E5T-mSEA)，用1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，可以使此融合蛋白高效表達(dá) (圖1A)。將低溫誘導(dǎo)的可溶性蛋白通過金屬螯合親和層析進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離、考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的融合蛋白有2條帶，主要條帶與預(yù)期的分子量相符，為34 kDa，另外一條則約為70 kDa (圖1B)。本實驗小組的前期研究發(fā)現(xiàn)純化的SEA在SDS-PAGE電泳后，仍有部分蛋白以二聚體形式存在 (另文發(fā)表)。因此70 kDa處的蛋白至少部分是因SEA二聚化而形成的E5T-mSEA二聚體。

2.2 抗融合蛋白血清的效價測定

將E5T-mSEA、rSEA及E5T免疫小鼠，結(jié)果表明所有E5T-mSEA、rSEA免疫組小鼠均產(chǎn)生了高滴度抗體 (圖 2)，用相應(yīng)蛋白包被檢測其效價，結(jié)果均在1:60 000以上；用TGFα及EGF包被檢測兩組血清樣品，結(jié)果在E5T-mSEA血清樣品中檢測到了針對TGFα和EGF的抗體，針對 TGFα的抗體效價為1:16 000，針對EGF的抗體效價為1:32 000。而所有E5T免疫組小鼠的血清，ELISA檢測為陰性。E5T與小鼠的TGFα和EGF均有較高的同源性，在本實驗條件下直接免疫小鼠所產(chǎn)生的抗體滴度很低，而與SEA融合后，可顯著提高抗體滴度，這表明SEA具有較強(qiáng)的免疫佐劑效應(yīng)。

2.3 抗融合蛋白抗體能夠?qū)GFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用

為了分析融合蛋白抗血清能否抑制EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的生長，首先對試驗細(xì)胞的EGFR的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在A431細(xì)胞中EGFR是高表達(dá)的，而在 293T細(xì)胞中則沒有 EGFR表達(dá)(圖3A)。

圖1 E5T-SEA融合蛋白的表達(dá)和純化Fig. 1 Expression and purification of E5T-SEA fusion protein in E. coli. (A) BL21(DE3) with pET-E5T-mSEA was induced with 1 mmol/L IPTG(lane 1), BL21(DE3) with pET-E5T-mSEA without induction (lane 2), BL21(DE3) with pET-22b(+) (lane 3), protein marker (lane 4). (B) Purified E5T-mSEA(lane 1), protein marker (lane 2).

圖2 免疫小鼠血清效價的測定Fig. 2 Detection of antibodies titers of serum from immunized mice. 40 mice were randomized into four groups and immunized with E5T-mSEA, rSEA, E5T or adjuvant only. To detect the titers of antibody against E5T-mSEA in serum of E5T-mSEA immunized mice, the E5T-mSEA were coated and corresponding serum were applied sequentially. To detect other antibodies against other interest proteins, the proteins and serum were applied in the same way as E5T-mSEA (serum from applied protein/coated protein).

圖3 E5T-mSEA抗血清能顯著抑制EGF/TGFα/EGFR依賴性腫瘤細(xì)胞的生長Fig. 3 E5T-mSEA anti-serum can inhibit the growth of EGF/ TGFα/EGFR dependent tumor cell lines significantly. (A) The expression level of EGFR in different tumor cell lines. E5T-mSEA anti-serum can inhibit the growth of EGF/TGFα/ EGFR dependent tumor A431 significantly (B, D). But has no effect on EGFR negative cell 293T(C, D). In figure B and C, ET means dilution ratio of E5T-mSEA anti-serum.

向293T 和A431細(xì)胞中分別加入不同稀釋度的抗E5T-mSEA或抗rSEA (陰性對照) 免疫血清培養(yǎng)24 h后，抗E5T-mSEA免疫血清幾乎可以將A431腫瘤細(xì)胞完全殺死，而對293T細(xì)胞的生長沒有明顯的影響，死亡率小于5% (圖3B、C)。表明抗E5T-mSEA免疫血清只對EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有抑制作用。

3 討論

腫瘤患者機(jī)體免疫處于抑制狀態(tài)[7]，腫瘤抗原在機(jī)體內(nèi)免疫原性下降，造成特異性細(xì)胞免疫激活不足，外周免疫耐受的狀況。因此，腫瘤疫苗設(shè)計策略的總體思路是應(yīng)用各種技術(shù)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別能力，改善免疫微環(huán)境，引發(fā)有力的特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫，阻止腫瘤進(jìn)展，最終消除腫瘤[8-9]。葡萄球菌腸毒素 A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA) 是金黃葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素之一，為sea基因編碼的257個氨基酸組成的多肽，是一種細(xì)菌超抗原，在極低劑量時即可直接與抗原提呈細(xì)胞 (Antigen presenting cell，APC) MHC II類分子和T細(xì)胞抗原識別受體 (T cell receptor，TCR)特異地結(jié)合，誘導(dǎo)T淋巴母細(xì)胞有絲分裂并促進(jìn)T細(xì)胞釋放IL-I、IL-2和TNF-7等多種細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-12]。研究報道將牛血清白蛋白BSA及HIV的gp160分別免疫小鼠，隨后再用SEA注射小鼠，發(fā)現(xiàn)由于超抗原的激活作用使針對胸腺依賴性抗原BSA、gp160的抗體滴度分別增加了3~4倍[13]。這項研究提示利用超抗原SEA來打破對同源蛋白的免疫耐受完全可能。目前，利用超抗原的免疫激活效應(yīng)來提高抗腫瘤抗原的免疫性已有成功應(yīng)用。比如，將SEA加上疏水的跨膜區(qū)域 (Transmembrane domain，TM) 尾巴以后用來修飾腫瘤衍生的exosome，定位于exosome的表面，形成Exo/SEA-TM，可以誘導(dǎo)腫瘤特異的cytotoxic T lymphocyte (CTL)，對腫瘤的生長具有明顯的抑制作用[14]。目前，還未見以其為佐劑進(jìn)行腫瘤疫苗的研究，本實驗對此進(jìn)行了初步的嘗試。

本實驗所構(gòu)建的E5T是EGF和TGFα的嵌合分子，其空間構(gòu)象與 TGFα、EGF的構(gòu)象非常相似，尤其是EGF (圖4)，推測其免疫原性可能會比較低，本實驗結(jié)果也證實了這一點，即直接以E5T免疫小鼠并不能產(chǎn)生高效價抗體 (圖2)。本研究以SEA作為E5T的載體蛋白，則能有效激活腫瘤攜帶體的免疫系統(tǒng)，打破E5T的同源耐受。實驗結(jié)果表明，融合蛋白E5T-mSEA免疫小鼠后可以產(chǎn)生高滴度的抗體，在E5T-mSEA中均檢測到了針對TGFα和EGF的抗體，針對TGFα效價為1:16 000，針對EGF的抗體為1:32 000 (圖2)。這提示將SEA作為載體蛋白能夠有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對E5T的抗體。

由于將佐劑與抗原分別注射進(jìn)行免疫給實際應(yīng)用帶來一定不便，將超抗原與靶抗原融合則使其臨床的可能性大為增加。由于SEA只能以完整分子的形式被MHC分子遞呈給T細(xì)胞，才能啟動增強(qiáng)免疫系統(tǒng)識別能力的反應(yīng)；另一方面，維持 E5T的構(gòu)象也有利于E5T表位 (線性表位和空間表位) 的完整性。因此，在將靶抗原與SEA進(jìn)行融合時，為了保證兩者空間構(gòu)象的完整性，在兩者之間添加了一個通用的8氨基酸連接肽 (GGGS)2，該肽已經(jīng)被證實能夠很好地保持融合蛋白己酮糖磷酸合成酶 (Hexulose phosphate synthase，HPS) (23 kDa) -GFP(27 kDa) 各自的構(gòu)象[15]。

圖4 E5T表位嵌合分子保持了與EGF和TGFα相似的空間構(gòu)象Fig. 4 The E5T shows similar conformation with that of EGF and TGFα.

本研究對以SEA為載體的EGFR配體疫苗進(jìn)行了探索，初步結(jié)果令人振奮。但有很多問題需要回答，如SEA是否能激活E5T特異性CD4+T細(xì)胞以及是否優(yōu)于現(xiàn)有的其他載體蛋白；盡管抗E5T包含了與EGFR結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域，抗E5T-SEA血清能識別EGF和TGFα，也能夠顯著抑制EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的生長，但由于 A431細(xì)胞的生長是依賴于EGF、TGFα之一還是同時依賴于兩者目前并不清楚。因而，E5T嵌合蛋白抗體對 EGF/EGFR、TGFα/EGFR相互作用的阻斷效率也不清楚。上述問題，有待后續(xù)研究中進(jìn)一步展開。

感謝：感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所曹誠教授和靳彥文博士提供有益的建議，感謝本實驗室其他同志的支持和幫助。

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