劉金林，陳硯，胡琳琳，貝為成，陳煥春

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

2 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

胸 膜 肺 炎 放 線 桿 菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae，APP) 為革蘭氏陰性桿菌，目前該菌共有15個(gè)血清型[1]，除血清13和14型細(xì)菌生長(zhǎng)為不依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD) 的生物Ⅱ型外，其余13種血清型菌均為依賴(lài)NAD生長(zhǎng)的生物I型，并都與豬致病相關(guān)。APP可引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，在世界各國(guó)均有發(fā)生，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。抗生素在預(yù)防和控制細(xì)菌性傳染病上曾起到很大作用，但隨著耐藥菌株的頻繁出現(xiàn)以及國(guó)家對(duì)抗生素使用的嚴(yán)格限制，疫苗將成為控制豬傳染性胸膜肺炎的主要手段。目前所使用的疫苗主要是全細(xì)菌滅活疫苗或亞單位疫苗。由于APP血清型多，各血清型之間交叉保護(hù)率較低，大大增加了防治該病的難度[3]。近年來(lái)，胸膜肺炎放線桿菌減毒活疫苗的研究，為該病的防治帶來(lái)新希望[4-6]。可以預(yù)見(jiàn)，應(yīng)用新型安全、高效的基因缺失疫苗將成為控制豬傳染性胸膜肺炎的一種趨勢(shì)。由于血清 7型胸膜肺炎放線桿菌不分泌毒素 ApxI僅分泌毒素 ApxII，而毒素 ApxI和毒素ApxII既是APP兩個(gè)主要的毒力因子，同時(shí)又是作為APP兩個(gè)關(guān)鍵的免疫保護(hù)性蛋白，因此，擬通過(guò)本研究探索提高胸膜肺炎放線桿菌弱毒疫苗免疫原性的途徑，同時(shí)可以通過(guò)該系統(tǒng)表達(dá)其他呼吸系統(tǒng)病原的重要免疫原，為呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防與控制提供新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。各種限制性?xún)?nèi)切酶、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程(大連) 有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。胰蛋白大豆瓊脂 (Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯 (Tryptic soy broth，TSB) 購(gòu)自美國(guó)Difco公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

胸膜肺炎放線桿菌血清7型apxIIC-基因缺失弱毒疫苗菌株HB04C-由本實(shí)驗(yàn)室貝為成博士構(gòu)建并保存[7]。血清1型胸膜肺炎放線桿菌SLW01為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。大腸桿菌Escherichia coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN由瑞士伯尼爾大學(xué)Joachim Frey教授惠贈(zèng)[8]。

1.1.3 引物

引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6~8周齡仔豬購(gòu)自湖北省某大型豬場(chǎng)，胸膜肺炎放線桿菌血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 APP基因組制備及apxIA基因擴(kuò)增

取血清1型APP分離株SLW01的新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)文獻(xiàn)[10]描述的方法提取APP基因組。以基因組為模板，通過(guò)引物P1和P2為擴(kuò)增到apxIA基因。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min ，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min。

表1 本研究所用引物及說(shuō)明Table 1 Primers used in this study

1.2.2 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將前述PCR產(chǎn)物apxIA基因連接到pMD18-T載體，得到質(zhì)粒pMD-apxIA，經(jīng)酶切鑒定正確后，以Pst I/Not I雙酶切，回收apxIA片段并連接到經(jīng)同樣酶切的穿梭質(zhì)粒 pJFF224-XN中，得到攜帶外源基因的穿梭質(zhì)粒pJFF-IA。

1.2.3 突變株的篩選

大量制備質(zhì)粒pJFF-IA，以電轉(zhuǎn)化將重組穿梭質(zhì)粒pJFF-IA轉(zhuǎn)化胸膜肺炎放線桿菌弱毒株HB04C-。胸膜肺炎放線桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備以及電轉(zhuǎn)化條件參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。經(jīng)過(guò)氯霉素抗性篩選，得到氯霉素抗性的菌株，再以PCR (引物P3/P4) 加以驗(yàn)證。將得到的突變株命名為 HB04C2 (apxIIC?/ apxIIA+/apxIA+)。

1.2.4 HB04C2的遺傳穩(wěn)定性分析

將得到的重組菌HB04C2分別在含有氯霉素抗性的TSA培養(yǎng)基和不含抗性的TSA培養(yǎng)基上傳20代，每代細(xì)菌均取樣，用引物P3/P4 PCR鑒定，以確定HB04C2的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 HB04C2分泌性外毒素的檢測(cè)

首先提取親本菌和重組菌株天然毒素[11]，然后以本實(shí)驗(yàn)室制備的抗ApxIA的單克隆抗體為一抗，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)[12]。

1.2.6 HB04C2的增殖能力分析

將過(guò)夜培養(yǎng)的HB04C-和HB04C2分別以1:1000比例接種到100 mL TSB培養(yǎng)基 (含NAD和10%小牛血清)，接種后每隔1 h取樣，測(cè)定菌液在600 nm下的吸光值，共計(jì)10 h，重復(fù)3次取平均值。比較2個(gè)菌株的增長(zhǎng)能力。

1.2.7 HB04C2對(duì)仔豬的免疫保護(hù)性研究

選取10頭健康仔豬 (6~8周齡，APP病原學(xué)血清學(xué)均為陰性)，隨機(jī)分為2組，每組5頭。將HB04C2 (活菌含量1×108CFU) 通過(guò)氣管接種免疫第一組仔豬，間隔2周，以同樣方式加強(qiáng)免疫，第二組仔豬接種TSB作為陰性對(duì)照。在一免前、二免前以及攻毒前通過(guò)前腔靜脈采血，用本實(shí)驗(yàn)室建立的ApxI-ELISA、ApxII-ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)毒素ApxIA、ApxIIA抗體[13-14]。第2次免疫2周后，連同TSB對(duì)照，用血清1型APP分離菌株SLW01 (活菌含量1×108CFU)通過(guò)氣管注射對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒，觀察攻毒后仔豬的狀態(tài)，并于7 d后將存活豬處死觀察剖檢病變。仔豬臨床癥狀指數(shù) (Clinical sign score) 的評(píng)定參考Tumamao等[15]描述的標(biāo)準(zhǔn)：0=無(wú)癥狀；1=呼吸頻率增加；2=腹式呼吸；3=咳嗽；4=呼吸困難；5=死亡。按照Hannan等[16]描述的方法評(píng)價(jià)仔豬肺部損傷情況：即將整個(gè)肺分成7個(gè)部分，按肺部病變程度給每部分評(píng)分，每部分的最高分為5分，損傷越大，分值越高，各部分分?jǐn)?shù)之和作為肺部損傷指數(shù) (Lung lesion score)。

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的apxIA基因產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，序列分析證實(shí)無(wú)堿基誤配。經(jīng)Pst I和Not I酶切apxIA并插入到穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN的T4啟動(dòng)子下游。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Pst I和Not I雙酶切后得到2條約為7000 bp和3000 bp的片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確 (圖1)。

2.2 穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的電轉(zhuǎn)化及HB04C2的篩選

通過(guò)高效電穿孔方法將穿梭質(zhì)粒pJFF-IA轉(zhuǎn)化到HB04C-。通過(guò)氯霉素抗性篩選，得到陽(yáng)性克隆，以apxIA N端特異性引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到826 bp特異片段，而親本菌HB04C-為陰性(圖略)。

圖1 重組質(zhì)粒pJFF-IA的酶切鑒定Fig. 1 Identification of pJFF-IA by enzyme digestion. M: DNA ladder 15 000; 1: pJFF-IA digested with Not I/Pst I.

2.3 HB04C2的生物學(xué)特性

HB04C2在含氯霉素培養(yǎng)基和不含氯霉素培養(yǎng)基連續(xù)傳代后，都能擴(kuò)增出apxIA N端826 bp特異片段 (圖略)，表明穿梭質(zhì)粒pJFF-IA在APP菌株HB04C2中能夠穩(wěn)定傳代。提取重組菌HB04C2和親本菌HB04C-的分泌性蛋白，用抗ApxIA單克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示重組菌HB04C2在110 kDa處出現(xiàn)一條特異性帶，與預(yù)期的分子量相當(dāng) (圖2)，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)另有一條略小的雜交帶，筆者推測(cè)其可能是apxIA從469~3069 bp的表達(dá)產(chǎn)物 (大小約為93.8 kDa)。而親本菌株HB04C-未出現(xiàn)該特異性帶，結(jié)果表明穩(wěn)定攜帶穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的基因工程重組菌株HB04C2能夠表達(dá)且分泌具有免疫學(xué)活性的ApxIA。重組菌HB04C2和親本菌HB04C-的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。可見(jiàn)重組菌和親本菌生長(zhǎng)能力差別不大，表明攜帶穿梭質(zhì)粒并沒(méi)有明顯影響APP的生長(zhǎng)速度。

圖2 SDS-PAGE (A) 和Western blotting (B) 檢測(cè)重組菌株ApxIA的表達(dá)Fig. 2 Detection of ApxIA secreted by HB04C2. (A) SDS-PAGE. (B) Western blotting. 1: HB04C2; 2: HB04C-.

圖3 HB04C2體外增殖能力分析Fig. 3 Growth ability of attenuated A. pleuropneumoniae strains in vitro.

2.4 HB04C2的免疫原性研究

2.4.1 免疫仔豬血清學(xué)檢測(cè)

結(jié)果顯示，經(jīng)氣管接種HB04C2后，在14 d可以檢測(cè)到ApxIA和ApxIIA的抗體，到首免后28 d，抗體提高很多 (圖 4)，與對(duì)照組比較差異均極顯著(P<0.01)，對(duì)照組的仔豬在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程血清抗體均呈陰性。

2.4.2 攻毒保護(hù)效果

對(duì)照組仔豬在攻毒后表現(xiàn)出厭食、喘氣、呼吸極度困難，有的口吐白沫等傳染性胸膜肺炎臨床癥狀，攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，解剖后可見(jiàn)肺部嚴(yán)重出血。氣管免疫組仔豬在攻毒后，當(dāng)天表現(xiàn)嗜睡、喘氣，但攻毒2 d后基本恢復(fù)正常；解剖只有1頭仔豬肺局部有出血點(diǎn)，其余4頭正常。免疫組的肺損傷指數(shù)顯著低于對(duì)照組 (P<0.01) (表 2)。結(jié)果表明，HB04C2能提供給仔豬對(duì)異源血清1型APP攻擊的有效保護(hù)。

圖4 仔豬血清抗體檢測(cè)Fig. 4 Evaluation of antibodies against ApxIA (A) and ApxIIA (B). * P < 0.01 compared with the TSB group.

表2 HB04C2免疫動(dòng)物的攻毒保護(hù)結(jié)果Table 2 Protection of pigs against challenge with heterologous virulent A. pleuropneumoniae serovar 1

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌是豬傳染性胸膜肺炎的致病菌，該病是一種急性或慢性呼吸道疾病，以肺部出血性、纖維素性和壞死性肺炎為特征，具有高度的傳染性，各種年齡的豬均可感染發(fā)病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫可預(yù)防APP的感染，而弱毒疫苗則以其高效和可誘導(dǎo)交叉保護(hù)的特點(diǎn)吸引著諸多研究者的目光。隨著分子生物學(xué)發(fā)展及APP分子致病機(jī)理研究的深入，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程方法，通過(guò)失活毒力相關(guān)因子，構(gòu)建低毒力甚至無(wú)毒力APP基因工程弱毒活疫苗菌株，成為目前豬傳染性胸膜肺炎疫苗研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

APP共有4種RTX毒素，分別為ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。其中ApxI有強(qiáng)的溶血活性和強(qiáng)細(xì)胞毒性，ApxII的溶血活性和細(xì)胞毒性都相對(duì)較弱，ApxIII無(wú)溶血活性，但有強(qiáng)的細(xì)胞毒性[17]。除ApxIV在所有血清型APP都存在外，每種血清型APP最多只含ApxI、ApxII、ApxIII中的兩種[17-18]。同時(shí)含有ApxI和ApxII的菌株表現(xiàn)為高致病性。本研究選用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的apxIIC基因缺失菌株HB04C-為親本菌株，是因?yàn)橄惹耙褜?duì)該基因缺失菌株的安全性、免疫原性和誘導(dǎo)動(dòng)物的免疫保護(hù)率都有了全面的研究[7,19]。該弱毒菌株免疫動(dòng)物能完全抵抗同源血清7型APP的攻擊，但對(duì)毒力最強(qiáng)的異源血清1型APP的保護(hù)率只有70%，因?yàn)樵撊醵揪瓴荒墚a(chǎn)生重要的保護(hù)性抗原ApxIA。為了提高HB04C-對(duì)異源血清1型APP的保護(hù)率，增強(qiáng)該菌株的免疫效力，本研究使用穿梭質(zhì)粒，可以在 HB04C-中穩(wěn)定表達(dá)ApxIA，且血清7型APP中含有apxIB/apxID基因，可以為ApxIA的分泌提供通道[17]。作為APP重要的免疫原，單獨(dú)免疫ApxIA天然毒素或原核表達(dá)產(chǎn)物[20]，或 ApxIA的部分片段[21]，或是某些抗原表位[22]，均可產(chǎn)生較好的保護(hù)效果。經(jīng)氣管免疫HB04C2后，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對(duì)ApxIA的抗體，表明重組菌株產(chǎn)生的ApxIA具有良好的免疫原性，經(jīng)過(guò)加強(qiáng)免疫后，ApxIA抗體水平顯著提高，表明該表達(dá)系統(tǒng)具有較高的表達(dá)活性，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可刺激動(dòng)物產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答反應(yīng)。以強(qiáng)毒血清1型APP攻擊后，空白對(duì)照組表現(xiàn)嚴(yán)重的胸膜肺炎癥狀并死亡，免疫組仔豬表現(xiàn)為輕微或中等程度的臨床癥狀，但于觀察期內(nèi)恢復(fù)正常，重組菌株對(duì)致死性劑量的強(qiáng)毒菌株的攻擊提供了完全保護(hù)，表明該菌株具有較好的交叉保護(hù)能力。

本實(shí)驗(yàn)中免疫方式為氣管注射免疫，其操作難度較大，易對(duì)仔豬造成應(yīng)激，而且在注射部位及周邊組織會(huì)水腫等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室曾嘗試采用滴鼻免疫，可以達(dá)到較好的免疫效果[23]。有資料顯示，可通過(guò)密閉的氣霧發(fā)生裝置，讓動(dòng)物吸入攜帶APP的氣溶膠來(lái)進(jìn)行接種，能達(dá)到較好的感染效果[24]。因此，對(duì)于弱毒疫苗在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中的推廣應(yīng)用，采用氣霧免疫或滴鼻免疫的方式可能會(huì)更加適用，但這些方法的廣泛應(yīng)用，還需要一段時(shí)間的探索。

雖然穿梭質(zhì)粒本身攜帶的抗生素抗性基因產(chǎn)生的食品安全隱患，有待進(jìn)一步改善，如構(gòu)建無(wú)抗生素基因的平衡致死系統(tǒng)。ApxIA的血清7型APP菌株的構(gòu)建及特性分析，為今后開(kāi)發(fā)以APP弱毒菌株為載體的呼吸系統(tǒng)疾病的新型多價(jià)疫苗以及研究APP的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

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