陳偉，韓波，錢垂文，劉秋英，熊盛

暨南大學生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地 廣東省生物工程藥物重點實驗室 基因工程藥物國家工程研究中心，廣州 510630

藍藻抗病毒蛋白-N (CVN) 是一種從藍藻 (又名藍細菌Cyanobacteria Nostoc ettipsosporum) 中分離得到的一種水溶性糖蛋白，其獨特的抗病毒活性最初是在一項抗人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 天然藥物篩選計劃中發(fā)現(xiàn)的，后來的研究表明其具有廣泛的抗病毒作用[1]。天然CVN相對分子質(zhì)量為11 kDa，一級結(jié)構(gòu)含有 101個氨基酸殘基，無翻譯后的修飾，帶有 2個內(nèi)部二硫鍵。CVN能特異地、高親合性地結(jié)合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣殼蛋白gp120上有效降低HIV-1病毒對細胞的感染，這一特點使它可以不受病毒變異的干擾[2]。此外，CVN具有抗流感病毒、埃博拉病毒、皰疹病毒和丙型肝炎病毒的活性[3-5]。CV-N具有較高的穩(wěn)定性，即使在很苛刻的物理化學條件下，如在未加緩沖液的情況下反復凍融，甚至沸水浴 (15 min) 都不會影響其結(jié)構(gòu)或生物活性，只有當二硫鍵被打斷、還原或者烷基化時，CV-N的活性才完全喪失[6]；這使得CVN蛋白成為一種很有價值的抗病毒藥物。

CVN蛋白分子量較小，且分子中有2個二硫鍵，使得該蛋白在大腸桿菌中表達困難[7]。早在CVN發(fā)現(xiàn)之初，CVN的重組表達研究就已經(jīng)開始，目前已在大腸桿菌、酵母菌和植物細胞中表達成功，但這些重組表達方法存在表達產(chǎn)量低、易形成包涵體且復性困難、易形成無活性的二聚體形式、融合表達出現(xiàn)氨基酸缺失、純化方法復雜等缺點[7-10]。

小分子泛素樣修飾蛋白 (Small ubiquitin-like modifier，SUMO) 和泛素具有類似生物學功能，廣泛存在于真核細胞中，發(fā)揮著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用 (SUMO化和去SUMO化)，調(diào)節(jié)蛋白在核質(zhì)間的運輸，幫助蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)正確的定位，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性以及抗泛素化等作用[11]。SUMO蛋白融合表達系統(tǒng)是一種有效地表達小分子量蛋白的表達方法，具有抗蛋白酶解、增加重組蛋白表達量、促進蛋白正確折疊、能準確無誤地切除融合標簽、純化工藝簡單等優(yōu)點[12-14]。本研究利用PCR人工合成CVN的DNA系列，通過分子伴侶SUMO融合CVN基因表達，希望能通過SUMO的助折疊功能實現(xiàn)CVN的可溶性表達。同時還研究了重組蛋白CVN與gp120蛋白的親和力以及體外抗病毒活性，為進一步研究并得到一種高效的抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及細胞系

宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET3c由本室保存。質(zhì)粒pET3c-SUMO由暨南大學醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心黃亞東博士惠贈。單純皰疹病毒 1 (HSV-1)F株購自武漢大學病毒研究所。Vero細胞、MT-4細胞、HIV-I/IIIB病毒購自美國典型菌種保藏中心 (ATCC)。

1.1.2 主要試劑

Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamH I購自寶生物 (大連) 有限公司。IPTG、蛋白Marker、引物由上海生工生物工程有限公司合成。Ni Sepharose TM 6 Fast Flow購自Amersham公司。MTT、WST購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR合成SUMO-CVN全序列

如圖 1所示，通過引物重疊延伸的方法合成SUMO-CVN的全長基因，首先通過多次PCR合成CVN基因，分別以 (F1-CVN、R1-CVN) 為引物對合成A1、以 (F2-CVN、R2-CVN) 為引物對合成A2、以 (F3-CVN、R3-CVN) 為引物對合成 A3、以(F4-CVN、R4-CVN) 為引物對合成A4、以(F4-CVN、R5-CVN)為引物對合成 A5，A5含有 CVN的全長DNA系列。以pET3c-SUMO為模板，F(xiàn)-sumo、R-sumo為引物對，合成的片段記為B，B含有SUMO全長DNA序列。利用B序列末端與A5序列前端的20 bp重疊互補序列，以 B和 A5為模板，(F1-SUMO，R5-CVN)為上下游引物對進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收DNA片段，得到SUMO-CVN全長DNA序列。

1.2.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析

將質(zhì)粒pET3c和SUMO-CVN全長序列分別用Nde I與BamH I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶把這兩個酶切產(chǎn)物連接起來，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET3c-SUMO-CVN。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，PCR及Nde I與BamH I雙酶切初步鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 表達菌株的篩選及誘導表達

測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，用含氨芐的平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，挑取單克隆到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。然后按1%比例接種到含氨芐的新鮮LB培養(yǎng)基試管中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6~1.0。加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，在20℃下誘導20 h，離心收集菌體，進行12%的SDS-PAGE分析，選擇目的蛋白高表達的單克隆進行菌株保存。

1.2.4 SUMO-CVN融合蛋白搖瓶發(fā)酵及純化

選取高表達菌株接種到1 L含氨芐 (100 mg/L)的 LB 培養(yǎng)基中，按 1.2.3節(jié)中的條件，誘導 20 h后，4℃、6000×g離心10 min收集菌體，?80℃凍融1次，然后將菌體沉淀以1∶10比例重新懸浮于結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑)，超聲破碎，4℃、25 000×g離心30 min收集上清和沉淀，12%的SDS-PAGE對SUMO-CVN表達蛋白的可溶性進行分析。

1.2.5 CVN蛋白純化及鑒定

用結(jié)合緩沖液平衡Ni-NTA樹脂，上完樣后用洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑) 進行洗脫，最后用洗脫緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L 咪唑) 進行目的蛋白SUMO-CVN的洗脫。融合蛋白SUMO-CVN經(jīng)Sephadex G-25分子篩脫咪唑，蛋白調(diào)整濃度至1 mg/mL，加入1 U SUMO蛋白酶/mg融合蛋白，在酶切緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2% Igepal，1.5 mol/L NaCl，10 mmol/L DTT) 中30℃酶切1 h。因SUMO、SUMO蛋白酶均含有6×His標簽，酶切后的樣品再經(jīng) Ni-NTA親和層析除去SUMO、未酶切的SUMO-CVN和SUMO蛋白酶后得到目的蛋白CVN。

1.2.6 CVN精確分子量的測定

重組蛋白 CVN脫鹽后送暨南大學生命與健康工程研究院，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF-MS) 測定其分子量。

1.2.7 gp120蛋白結(jié)合實驗

用ELISA方法分析SUMO-CVN和CVN與gp120蛋白的結(jié)合能力，gp120蛋白用包被緩沖液(0.05 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaHCO3，pH 9.6) 溶解，96孔板酶標板中每孔加入100 μL gp120蛋白溶液，4℃包被過夜。用PBST (0.1% Tween20的PBS)洗板3次，再每孔加入100 μL含15%牛血清的PBST于37℃封閉2 h。PBST洗板3次之后，每孔加入100 μL的10倍系列稀釋的待檢測的蛋白樣品，樣品濃度從10?6μg/mL至100 μg/mL，每個濃度做3個復孔；同時BSA作為陰性對照，37℃孵育2 h。PBST洗板3次之后，每孔加入100 μL CVN的多克隆抗體(1∶4000稀釋)，37℃孵育2 h。PBST洗板3次之后，每孔加入 100 μL辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 Ig的單克隆抗體，37℃孵育2 h。PBST洗板3次之后TMB顯色，2 mol/L H2SO4終止顯色，450 nm測定吸光值。

1.2.8 重組 CVN蛋白抗皰疹病毒活性測定

單層Vero細胞中，加入不同稀釋度的蛋白樣品，5% CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，室溫避光放置30 min，振搖培養(yǎng)板10 min左右，酶標讀數(shù)儀比色 (波長 570 nm，參比波長630 nm)，測定吸光度并計算樣品的半數(shù)毒性濃度(50% cytotoxic concentration，CC50)。

單層Vero細胞中，加入不同稀釋度的蛋白樣品和100 TCID50的HSV-1病毒液各50 μL，同時設(shè)正常細胞對照及病毒對照組，CPE法觀察藥物對細胞的活性。

1.2.9 WST-1法測定重組CVN蛋白抗HIV-1活性

在P3生物安全柜中，重組CVN用含10% FBS 的 RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至 50 μg/mL (4.53 μmol/L)、10 μg/mL (0.91 μmol/L)、2 μg/mL (180 nmol/L) 和0.4 μg/mL (36 nmol/L)，共4個濃度梯度；收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MT-4細胞，計數(shù)細胞總數(shù)和活細胞數(shù)，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105cell/mL；取100 μL細胞懸液至96孔板中，加入100 TCID50的HIV-1/IIIB病毒 (50 μL/孔)，再加入預(yù)先稀釋好的不同濃度CVN樣品 (50 μL/孔)，每個樣品平行設(shè)置4個復孔，同時設(shè)空白對照、細胞對照、病毒對照和陽性對照(AZT，63 nmol/L) 各4個復孔；37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，加入10 μL/孔 WST-1 (5 mmol/L)溶液，37℃孵育4 h，450 nm測定吸光值。毒性測定與抑制率測定方法相同，但各培養(yǎng)板孔中只加細胞和待測樣品，不加病毒。計算公式：抑制率 (IR) = (As?Av)/(Ac?Av)；As：樣品吸光值均值；Av：病毒對照組吸光值均值；Ac：細胞對照組吸光值均值。

2 結(jié)果

2.1 SUMO-CVN的DNA序列的合成及表達載體的構(gòu)建

利用PCR方法，分別合成DNA片段A1 (97 bp)、A2 (173 bp)、A3 (241 bp)、A4 (298 bp)、A5 (360 bp)和B (345 bp)。A5含有CVN的DNA全序列，B含 SUMO的DNA全序列，利用A5和B之間20 bp的重疊互補序列合成SUMO-CVN的全長DNA序列(642 bp)，其大小與預(yù)期一致 (圖2)。所構(gòu)建的含表達質(zhì)粒pET-3c-SUMO-CVN的DH5α經(jīng)菌落PCR鑒定 (圖 3)，送陽性克隆去測序，結(jié)果表明，其序列與預(yù)期一致。

2.2 SUMO-CVN表達蛋白的搖瓶發(fā)酵及可溶性分析

將誘導前、誘導后、菌體裂解后的沉淀和菌體裂解后的上清等樣品進行 SDS-PAGE。結(jié)果表明，BL21(DE3)/pET-SUMO-L-CVN陽性克隆菌株經(jīng)誘導后會表達大小約為28 kDa的融合蛋白，未誘導對照無明顯表達，表達量占菌體總蛋白的28%，且融合蛋白多數(shù)位于上清中，是可溶性表達 (圖4)。

2.3 CVN蛋白的純化及鑒定

圖2 PCR合成SUMO-CVN的DNA系列Fig. 2 PCR artificial synthesis the whole target DNA sequence of SUMO-CVN. M: DNA marker; 1: A1; 2: A2; 3: A3; 4: A4; 5: A5; 6: B; 7: SUMO-CVN.

圖3 重組PET-SUMO-L-CVN質(zhì)粒限制酶和PCR分析Fig. 3 Restriction and PCR analysis of recombinant plasmid pET-SUMO-CVN. M: DNA marker; 1: pET-SUMO-L-CVN/ Nde I+BamH I; 2: PCR product of random clone.

取上清進行 Ni-NTA樹脂親和純化，純化后的目的蛋白經(jīng) Sephadex G-25分子篩脫咪唑后進行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。酶切產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析表明，30℃，1 h條件下80%的融合蛋白可以被酶切開。酶切產(chǎn)物再次用Ni-NTA親和層析柱進行純化得到目的蛋白 CVN，SDSPAGE電泳分析 (圖5) 表明純化的CVN蛋白純度較高?；|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDITOF-MS) 測定重組蛋白的分子量，CVN分子量測定結(jié)果為11 019.87 Da (圖6)，與天然CVN蛋白理論分子量11 013.16 Da相差5 Da，在合理誤差范圍內(nèi)。

圖4 SUMO-CVN的可溶性分析Fig. 4 Solubility analysis of SUMO-CVN. M: protein marker. 1: uninduced sample; 2: protein of BL21 (DE3)/pET-3c-SUMO-CVN after induced with IPTG; 3: induced recombinant BL21 supernatant; 4: induced recombinant BL21 precipitation.

圖5 SDS-PAGE分析重組蛋白CVN的純化Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purified CVN. M: protein marker; 1: the supernatant of cells; 2: the fractions of penetration; 3: the eluted fractions with 40 mmol/L imidazole; 4: the eluted fractions with 200 mmol/L imidazole; 5: the eluted fractions of G-25 chromatography; 6: SUMO protease cleaved mixture; 7: the eluted fractions of the second Ni-NTA chromatography.

圖6 MATOL-TOF MS測定重組蛋白CVN的分子量Fig. 6 Molecular weight of rCVN determined by matrixassisted laser desorption ionization coupled to a time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).

2.4 重組蛋白抗HSV活性分析

圖7是一次典型實驗后細胞在相差顯微鏡下的形態(tài)，可見病毒對細胞所致的細胞病變效應(yīng)，以及藥物對細胞的保護效應(yīng)。結(jié)果表明，重組CVN具有良好的抗HSV-1活性，摩爾濃度更低的條件下，CVN表現(xiàn)出與陽性對照藥物 ACV基本接近的抗病毒活性。未酶切過的 SUMO-CVN同樣具有抗單純皰疹病毒I型活性，但其活性要低于CVN蛋白，推測可能是由于多余的肽段影響了CVN蛋白的活性位點。毒性測定結(jié)果表明，SUMO-CVN和CVN對Vero細胞的毒性明顯低于ACV (表2)。

表2 MTT法測定樣品抗HSV-1活性結(jié)果Table 2 Cytotoxicity to vero cells of native rCVN

2.5 CVN與gp120蛋白的親和力

ELISA實驗分析重組蛋白與gp120蛋白的結(jié)合力，結(jié)果表明，無論是融合蛋白還是CVN與gp120蛋白都有較高的親和力，并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性 (圖8)。

2.6 重組蛋白CVN抗HIV活性結(jié)果

病毒對MT-4細胞所致的病變效應(yīng)，以及CVN對MT-4細胞的保護效應(yīng)如圖9所示。WST-1實驗表明，CVN具有明顯抑制HIV-1/IIIB的活性，在濃度為10 μg/mL (0.91 μmol/L) 時，抑制率為73%，細胞密度為無病毒細胞對照組的95%，與陽性藥物AZT的抑制率和毒性相當 (74%和101%)，為高效低毒抗病毒物質(zhì)。

3 討論

圖7 重組蛋白抗HSV-1的細胞病變觀察結(jié)果Fig. 7 Cytopathic effect of vero cells.

圖8 ELISA分析重組蛋白與gp120的親和力Fig. 8 Recombinant protien binding to gp120 by ELISA.

圖9 重組蛋白抗HIV-1/IIIB的細胞病變觀察結(jié)果Fig. 9 Cytopathic effect of MT-4 cells.

CV-N能特異地、高親和性地結(jié)合在人免疫缺陷病毒 HIV-I的衣殼蛋白 gp120上從而發(fā)揮抗病毒活性，這一特點使它可以不受病毒變異的干擾，同時它還具有抗病毒譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，這使得CV-N蛋白成為一種很有價值的抗病毒藥物。但因為該蛋白分子量較小，且分子中有2個二硫鍵，此外，其與目前已知的蛋白的系列相似性不超過20%，使得該蛋白在大腸桿菌中表達困難[15]。Boyd等人工合成了CV-N序列，經(jīng)PCR擴增后克隆于pFLAG質(zhì)粒上，構(gòu)建成分泌型表達載體，并在E. coli中誘導表達成功；但該表達產(chǎn)物是一系列完整蛋白、缺失N端前2個殘基的蛋白和含有ompA信號肽序列的蛋白的混合物，純化極為困難，且活性較低[1]。Mori等用pelB 信號肽序列替換ompA，并在pET26b(+)載體中表達成功，ESIMS分析和N端的序列測定證明與天然CV-N的結(jié)構(gòu)相同，并且具有抗HIV活性，但該表達重組蛋白的方法產(chǎn)量較低，每升高密度培養(yǎng)產(chǎn)物最高只能純化得到10 mg目的蛋白，無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要[16]。此外，呂銳等[17]和劉玉生等[18]都在大腸桿菌中成功表達了CVN蛋白，但都是以包涵體形式表達的，純化過程復雜。本實驗室先前構(gòu)建了pET3c-CVN的表達載體轉(zhuǎn)化到BL21中，經(jīng)過誘導之后，發(fā)現(xiàn)CVN蛋白沒有表達。因此，希望通過SUMO分子伴侶與CVN基因融合，以促進CVN的表達。本實驗將CVN與SUMO融合后，表達量明顯提高；并且主要是以可溶的形式表達的，純化后的CVN蛋白的純度較高，克服了其他表達方法產(chǎn)量低、易形成包涵體、純化困難等缺點，為今后開展產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

體外抗病毒活性實驗中，融合蛋白SUMO-CVN和 CVN蛋白均具有良好的抗 HSV-1活性，但是SUMO-CVN抗HSV-1活性要弱于CVN，推測可能由于多余的肽段影響了CVN蛋白抗HSV-1的活性位點。重組蛋白CVN與gp120蛋白有較高的親和力，從理論上說明了CVN具有抑制HIV病毒感染的活性。另外，WST-1實驗也證明，重組蛋白CVN也具有明顯的抑制 HIV-1/IIIB活性，為高效低毒抗病毒物質(zhì)。

致謝：感謝日本長崎大學藥學部感染分子藥學研究室郭朝萬博士、北里海雄準教授協(xié)助進行HIV-1/IIIB活性測定。

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