哈卓，趙麗麗，于曉旭，宗曉淋，毛雅元，張健，李一經，葛俊偉，喬薪瑗，唐麗杰

1 東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030

2 東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030

3 東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030

乳鐵蛋白 (Lactoferrin，LF) 是一種天然活性鐵離子結合糖蛋白，分子量約為80 kDa，廣泛存在于動物的乳汁 (初乳)、血液、唾液、小腸液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中[1-3]。乳鐵蛋白是一種具有多種生物學功能的蛋白質，它不僅參與鐵的轉運，而且具有抗微生物、調節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[4-7]。LF對細菌生長的抑制作用被認為是清除介質中的鐵，由于細菌需要鐵離子以維持生長，因此乳鐵蛋白在結合鐵離子的同時起到了抑制需鐵細菌的生長，進而導致病原菌死亡[8]。在一個乳鐵蛋白分子中含有2個鐵結合位點，它包括2個結構相似的葉片狀結構，分別被命名為N-葉和C-葉，2個葉片被一條短肽鏈連接[9]。乳鐵蛋白肽是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境條件下經胃蛋白酶水解的一段小肽，位于乳鐵蛋白的N-葉，它具有比乳鐵蛋白更強的抗菌活性[10-11]，許多研究表明，乳鐵蛋白的生物學性都與N-葉密切相關[12]。

本研究利用 RT-PCR方法，從豬的乳腺組織中擴增出豬乳鐵蛋白N-葉基因，以此為參考模板，重新優(yōu)化設計并合成了豬乳鐵蛋白N-葉片段，插入到原核表達載體 pET-30b中，得到高效表達，并進行了包涵體的裂解、純化和復性，得到了具有抑菌活性的重組豬乳鐵蛋白，為進一步研究其抗病毒和免疫調節(jié)功能提供了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種及主要試劑

表達載體質粒 pET-30b和大腸桿菌 JM109及BL21(DE3) 均由本實驗室保存。金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureas CVCC25923株和大腸桿菌Escherichia coli CVCC10141株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，益生菌干酪乳桿菌ATCC393株由荷蘭NIZO研究所惠贈。

小量DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。限制性內切酶及pMD18-T載體購自TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司。針對His標簽的單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司。

1.2 豬乳鐵蛋白基因的擴增和基因優(yōu)化

1.2.1 引物設計

根據(jù)GenBank登錄的豬乳鐵蛋白基因序列，在其可讀框兩側設計一對引物，上游引物P1:5′-GGATCC AATGAAGCTCTTCATCCC-3′和下游引物P2:5′-CTCGAGCTTCGCCTGCCGCGC-3′分別含有BamH I酶切位點、Xho I酶切位點 (下劃線標示)，由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 豬乳鐵蛋白RNA的提取與基因擴增

取泌乳 3 d的長白豬乳腺組織在液氮中研磨成粉末，按照每50~100 mg組織加入1 mL Trizol液裂解乳腺組織細胞，以氯仿、異丙醇抽提乳腺組織中的總RNA，在以P1為引物進行逆轉錄后，再以P1和P2為引物通過PCR方法擴增出1077 bp的PLF-N基因片段。將其經膠回收純化，與 pMD18-T載體連接，轉化JM109感受態(tài)細胞，經質粒提取后進行酶切及 PCR鑒定，獲得陽性重組質粒，命名為pMD-PLF-N，送上海生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.2.3 基因的優(yōu)化設計與合成

以1.2.2中應用RT-PCR方法擴增的PLF-N基因為參照序列，利用在線軟件，將序列中的稀有密碼子改為大腸桿菌優(yōu)勢密碼子，優(yōu)化了密碼子適應性指數(shù)，根據(jù)已報道文獻，將密碼子改為利于大腸桿菌表達的密碼子[13]，重新設計并合成了優(yōu)化后的豬乳鐵蛋白PLF-NS基因。

1.3 表達豬乳鐵蛋白PLF-NS基因和PLF-N基因重組菌的構建

將PLF-NS基因、PLF-N基因和原核表達載體pET-30b 質粒，分別經BamH I和Xho I雙酶切后，膠回收純化試劑盒回收目的基因，經T4 DNA連接酶連接，轉化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞。挑取單個菌落提取質粒，經酶切、PCR鑒定后，獲得含有陽性重組質粒的菌株，分別命名為 pET-PLF-NS/ BL21(DE3) 和pET-PLF-N/BL21(DE3)。

1.4 基因表達條件的優(yōu)化和表達產物的鑒定

1.4.1 表達條件的選擇及優(yōu)化前后表達量的比較

為了獲得重組蛋白的最佳表達量，取少量重組菌種 pET-PLF-NS/BL21(DE3)過夜培養(yǎng)，按 1∶100比例接種于100 mL含氨芐青霉素100 mg/L LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600在0.4~0.6之間時，分別于28℃、32℃、37℃條件下以0.4 mmol/L的IPTG進行誘導，在誘導后的6 h內，每隔1 h取樣進行SDS-PAGE分析，確定最佳表達條件，用BandScan軟件分析重組蛋白表達量，并在相同條件下對未優(yōu)化的重組菌pET-PLF-N/BL21(DE3) 誘導表達，比較優(yōu)化前后重組蛋白表達量的變化。

1.4.2 融合蛋白的表達形式分析及Western blotting鑒定

誘導后菌液經超聲波破碎后，在4℃下，10 000×g離心10 min，上清和沉淀同時進行SDS-PAGE分析。同時將誘導前和誘導后的重組蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印到硝酸纖維素膜上，以針對 His標簽的單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blotting分析確定蛋白的表達。

1.5 重組蛋白表達產物的純化及復性

收集誘導后的表達菌體，重懸于PBS (pH 7.4)緩沖液中，加入溶菌酶，37℃作用30 min后，置冰浴中超聲裂解，功率300 W，3 s/次，間隔時間3 s，至不再粘稠。4℃、10 000×g離心10 min，用溶液I (0.01 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，2 mol/L尿素)重懸沉淀，8 000×g離心10 min，再加入溶液II (0.01 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，4 mol/L尿素)重懸沉淀，8 000×g離心10 min，收集上清液，得到初步純化的包涵體，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述包涵體溶解到裂解液中 (0.01 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，8 mol/L 尿素)。4℃下磁力攪拌器溶解過夜。采用親和層析法純化表達蛋白，參照 Qiagen公司鎳離子親和層析柱 (Ni2+NTA) 操作說明進行，在洗脫液中加入 0.1% Triton-100和10%丙三醇加以改進。

將純化后的蛋白進行尿素梯度透析復性，依次在含有6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.0、0.5和0 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (含有20 mmol/L巰基乙醇，0.3 mol/L NaCl，10%丙三醇，pH 9.0) 中透析各4 h (4℃)，將裂解液中的尿素替換出來。通過SDS-PAGE及BandScan軟件檢測純化后的樣品純度。

1.6 重組蛋白的抑菌活性檢測

重組蛋白的抑菌活性檢測采用瓊脂孔穴擴散抑菌圈法[14]，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌接種到5 mL LB中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。乳桿菌接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取10 μL細菌培養(yǎng)液加入到1 mL的培養(yǎng)基中混勻，涂于瓊脂平板，待菌液稍干后，放置牛津杯，加入200 μL復性超濾濃縮的1 g/L重組蛋白，對照采用最后一次透析液，拍照觀察并測定清晰的抑菌圈直徑。

取滅菌的干凈試管10支，分成兩組，每組5支，編號 1~5，然后將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再將其稀釋至105/mL，每支試管中加入0.5 mL。再向第一支試管中加入0.5 mL超濾濃縮的重組蛋白，混勻后取 0.5 mL加入到第二支試管中，同樣的方法一直稀釋到第五支試管中，1~5管中重組蛋白的濃度分別 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 g/L，37℃作用18 h，觀察細菌生長狀況，確定MIC值[15]。

2 結果

2.1 重組質粒pMD-PLF-N的鑒定

重組質粒pMD-PLF-N用BamH I或Xho I單酶切后得到大小約為3.6 kb的基因片段，用BamH I和Xho I雙酶切后得到大小約為1.0 kb和2.6 kb基因片段，以P1/P2為引物進行PCR擴增，得到約為1.0 kb基因片段，與預計大小相符合。表明 PLF-N基因片段插入到克隆載體pMD18-T中。

測序結果表明獲得大小為1.0 kb的PLF-N基因與預期相符，通過與GenBank上已發(fā)表的序列相比對，結果表明本研究獲得的長白豬 PLF-N基因與GenBank序列AY306198.1、M81327.1、L77887.1及M92089.1的核苷酸同源性分別達99.16%、99.07%、99.63%和99.35%，可見PLF-N基因在核苷酸序列上高度保守。

2.2 基因優(yōu)化

將序列中的稀有密碼子換成有利于大腸桿菌表達的優(yōu)勢密碼子，使全基因的密碼子適應性指數(shù)由原來的0.2提高到0.5，優(yōu)化后的基因序列和對應的氨基酸序列如圖1。

2.3 重組表達載體的鑒定

挑取單菌落過夜培養(yǎng)，提取質粒經 BamH I和Xho I單、雙酶切和PCR鑒定均表明與預期大小的核酸片段相一致。將鑒定正確的陽性質粒轉化到表達菌 BL21(DE3) 中，獲得重組菌株 pET-PLF-NS/ BL21(DE3) 和pET-PLF-N/BL21(DE3)。

2.4 蛋白的誘導表達

對重組菌的最佳表達條件研究，結果表明基因優(yōu)化后的重組菌在28℃誘導3 h表達量最大，相對分子質量約為42 kDa (圖2)，經薄層掃描分析表明目的蛋白表達量可占菌體總蛋白的32%。而野生型重組菌蛋白表達量較低，表明通過基因優(yōu)化明顯提高了重組蛋白的表達量。

圖1 優(yōu)化后的基因序列和對應的氨基酸序列Fig. 1 Optimized gene sequence and its deduced amino acid sequence.

2.5 重組蛋白表達產物的Western blotting鑒定

由于 pET-30b為表達載體所表達的融合蛋白帶His標簽，以針對 His標簽的單克隆抗體為一抗和HRP標記的山羊抗鼠 IgG為二抗，進行 Western blotting分析在42 kDa位置出現(xiàn)了特異的反應帶，說明目的蛋白得到了表達 (圖3)。

2.6 重組蛋白的純化與復性

通過SDS-PAGE分析，上清液中未檢測到目的蛋白，發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于沉淀中，說明該目的蛋白以包涵體形式存在。經包涵體提取、鎳離子親和層析柱純化變性的融合蛋白，得到了純化后的重組蛋白 (圖4)。經BandScan軟件分析，蛋白的純度達到98%以上。

2.7 重組PLF-NS蛋白的抑菌活性檢測

圖2 重組菌誘導表達的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of induced recombinant strain.1: protein molecular weight marker; 2: non-induced expression of pET-PLF in E. coli BL21(DE3); 3: expression of wild-type gene in E. coli BL21(DE3) induced for 3 h; 4: expression of optimized gene in E. coli BL21(DE3) induced for 3 h.

抑菌試驗表明，重組蛋白對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，對大腸桿菌的抑菌作用較弱，而對益生菌干酪乳桿菌沒有觀察到抑菌作用 (圖 5)。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為13 mm和6 mm。對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.0 g/L，對大腸桿菌的最小抑菌濃度大于2.0 g/L。

圖3 重組蛋白的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of recombinant protein PLF-NS. 1: protein molecular weight marker; 2: non-induced expression of pET-PLF-NS in E. coli BL21(DE3); 3: induced expression of pET-PLF-NS in E. coli BL21(DE3).

圖4 包涵體和純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the inclusion and purified fusion protein. 1: protein molecular weight marker; 2: inclusion body of recombinant strain pET-PLF-NS/BL21(DE3); 3?6: purified fusion protein of inclusion body from recombinant strain pET-PLF-NS/BL21(DE3).

圖5 重組PLF-NS蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和益生菌干酪乳桿菌的抑菌活性Fig. 5 Antimicrobial activities of recombinant PLF-NS to S. aureas CVCC25923, E. coli CVCC10141 and L. casei ATCC393. 1, 4, 6: control assay; 2: S. aureas CVCC25923; 3: E. coli CVCC10141; 5: L. casei ATCC393.

3 討論

由于傳統(tǒng)的乳鐵蛋白分離從初乳中進行提取純化工藝繁瑣、價格昂貴，利用基因工程方法生產乳鐵蛋白顯得尤為重要。大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中發(fā)展最早，目前應用最廣泛的經典表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、目的基因表達水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強等特點[16]。但利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行表達時，往往會遇到外源蛋白的低表達或不表達[17]，在進行本研究時就遇到了蛋白表達水平低的問題，所以為了得到高水平表達的蛋白進行了基因的優(yōu)化，主要對密碼子的偏愛性、密碼子適應指數(shù)、串聯(lián)密碼子對進行了分析，在保證氨基酸不變的情況下，利用在線軟件對基因進行改進，和未改進前相比明顯提高了蛋白的表達量。結果證明通過基因優(yōu)化的方式對表達量低或不表達的基因進行改造使之高效表達是一種提高表達效率的有效手段。

pET系統(tǒng)是現(xiàn)今原核表達方面使用最廣泛的系統(tǒng)，本實驗所選用的pET-30b載體受強噬菌體T7轉錄及翻譯信號控制，表達由宿主細胞提供的T7 RNA聚合酶誘導，充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白[18]。載體中含有 His標簽，可以用親和層析方法純化融合蛋白。通過對表達條件的優(yōu)化，表達蛋白可達到全菌體的32%。由SDS-PAGE和Western blotting分析，特異性條帶所處的位置分子量大約為 42 kDa，與理論計算的分子量相一致，直接證明了PLF-N可讀框的完整性。在生產中考慮到蛋白酶的價格昂貴，本實驗使用 pET-30b載體，由于融合標簽小，表達產物經純化復性后無需進行標簽的切除，就可以得到具有生物學活性的豬乳鐵蛋白。

在純化過程中出現(xiàn)了蛋白的聚集，嚴重影響了純化效率，后經過加入 0.1% Triton-100和10%丙三醇避免了蛋白的聚集，大大提高了純化效率。采用尿素梯度透析的復性方法，由于蛋白的濃度和復性液的pH值對蛋白復性的好壞起著決定性的影響，當?shù)鞍诐舛冗^高時幾乎所有的蛋白都發(fā)生了聚集，復性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復性效率[19]，所以本研究嘗試了不同的初始蛋白濃度和不同的pH值，最后確定蛋白濃度為0.1~0.2 mol/L，pH值為9.0時，蛋白得率最高。

體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)豬乳鐵蛋白對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌均有抑菌作用，而對益生菌乳酸菌無抑菌作用；其中尤以對金黃色葡萄球菌抑菌作用明顯，反映出豬乳鐵蛋白與其他乳鐵蛋白一樣，在抗菌活性作用上均表現(xiàn)為對革蘭氏陽性菌抑制作用比革蘭氏陰性菌要明顯些。這可能與G+菌和G?菌的細胞膜構成差異有關，乳鐵蛋白結合到細胞膜上，引起細胞膜的變化方式或者程度有可能不同，從而產生抑菌活性的差異。有關重組豬乳鐵蛋白的其他生物學功能將有待于進一步研究。本試驗獲得重組豬乳鐵蛋白的高效表達也為生物功能蛋白通過基因優(yōu)化獲得高效表達提供參考，為基因工程重組豬乳鐵蛋白在生產應用中奠定基礎。

REFERENCES

[1] Rey MW, Worldshuk SL, DeBeor HA, et al. Complete nucleotide sequence of human. Nucleic Acid Res, 1990, 18(17): 5288?5289.

[2] Johansson B. Isolation of an iron-containing red protein from human milk. Acta Chem Scand, 1960, 14: 510?512.

[3] Montreuil J, Tonnelat J, Mullet S. Preparation and properties of lacto-transferrin of human milk. Biochim Biophys Acta, 1960, 45: 413?421.

[4] Bluard-Deconinck JM, Masson PL, Osinski PA, et al. Amino acid sequence of cystic peptides of lactoferrin and demonstration of similarities between lactoferrin and transferring. Biochim Biophys Acta, 1974, 365(2): 311?317.

[5] Farnaud S, Evans RW. Lactoferrin-a multifunctional protein with antimicrobial properties. Mol Immunol, 2003, 40: 395?405.

[6] Elizabeth JD. Antibiotic properties of bovine Lf on helicobacter pylori. Digest Dis Sci, 1998, 43(12): 2573?2812.

[7] Britigan BE, Lewis TS, Waldshcmidt M, et al. Lactoferrin binds CpG-containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects on human B cells. J Immunol, 2001, 167: 2921?2928.

[8] Reyes RE, Manjarrez HA, Drago ME. E1 hierro and la virulencia bacteriana. Enf Inf Microbiol, 2005, 25: 104?107.

[9] Anderson BF, Baker HM, Norris GE, et al. Structure of human lactoferricin: crystallographic structure analysis and refinement at 2.8 A resolution. J Mol Biol, 1989, 209: 711?734.

[10] Dionysius DA, Milne JM. Antibacterial peptides of bovine lactoferrin: purifcation and characterization. J Dairy Sci, 1997, 80(4): 667?674.

[11] BeIlamy W, Takase M, Yamauchi K, et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochim Biophys Acta, 1992, 1121(2): 130?136.

[12] Nakamura I, Watanabe A, Tsunemitsu H, et al. Production of recombinant bovine lactoferrin N-lobe in insect cells and its antimicrobial activity. Protein Expr Purif, 2001, 21(3): 424?431.

[13] Svetlana B, Georgi C, Ivan I. Codon pairs in the genome of Escherichia coli. Bioinformatic, 2003, 19(18): 987?998.

[14] Bu XJ, Du XJ, Zhou WJ, et al. Molecular cloning, recombinant expression and characterization of lysozyme from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. Chin J Biotech, 2008, 24(5): 723?732.卜興江, 杜欣軍, 周文杰, 等. 中國明對蝦溶菌酶基因克隆、重組表達與性質分析. 生物工程學報, 2008, 24(5): 723?732.

[15] Xu SY, Chen X. Pharmaco-experiment Methodology. Beijing: People’s Health Press, 2001: 797?889.徐叔云, 陳修. 藥理實驗方法學. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001: 797?889.

[16] Swartz JR. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol, 2001, 12(2): 195?201.

[17] Grantham R, Gautier C, Gouy M, et al. Codon catalog usage and the genome hypothesis. Nucleic Acids Res, 1980, 8: 49?62.

[18] Novagen. pET System Manual. 9th ed. 2000.

[19] Xie Y, Wetlaufer DB. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic. Protein Sci, 1996, 5(3): 517?523.