王景鋒，邵軍軍，李菁，高閃電，獨(dú)軍政，叢國正，林彤，?；菔|

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046

口蹄疫 (Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性并可遠(yuǎn)距傳播的動物疫病。FMDV宿主廣泛，口蹄疫發(fā)生后由于造成動物生產(chǎn)能力下降，發(fā)病地區(qū)畜產(chǎn)品上市和出口受限以及為撲滅和控制疫情所用的巨額開支常給地區(qū)和國家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。人們在與FMD長期的斗爭過程中已經(jīng)充分認(rèn)識到，應(yīng)用疫苗進(jìn)行免疫接種是預(yù)防、控制乃至消滅 FMD的有效手段之一。常規(guī)的弱毒疫苗與滅活疫苗由于其良好的免疫原性和提供的較高保護(hù)力，從而在過去和當(dāng)前FMD防控中發(fā)揮了重大作用。但是這些傳統(tǒng)疫苗都存在多種缺點(diǎn)，如安全性不足、需要嚴(yán)格地冷鏈運(yùn)輸及給區(qū)別自然感染動物與免疫動物帶來很大困難等。為克服傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)研制生物安全、優(yōu)質(zhì)高效、價(jià)廉的新型疫苗已經(jīng)迫在眉睫，而且成為FMDV相關(guān)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是以后疫苗發(fā)展的必然趨勢[1]。

本研究擬在克隆Asia I型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因并對其序列進(jìn)行測定和分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和化學(xué)合成FMDV抗原表位基因，將其與綿羊免疫球蛋白IgG重鏈恒定區(qū)編碼基因串聯(lián)后在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)，從而獲得由羊免疫球蛋白IgG重鏈恒定區(qū)作為載體蛋白攜帶FMDV抗原表位的多肽抗原，對該融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定后，檢測其誘發(fā)豚鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況。以期為進(jìn)一步研制羊的FMDV表位肽疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及主要試劑

Asia I Jiangsu/China/2005 FMDV由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保存，BHK-21細(xì)胞、大腸桿菌JM109、BL21 (DE3) 及原核表達(dá)載體pPROEx HTb由本室保存，pGEM T-easy克隆載體購自Promega公司。限制性核酸內(nèi)切酶、RT-PCR反應(yīng)試劑盒 (TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0)、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、低分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒均購自寶生物工程 (大連) 有限公司，RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit(50)) 購自Qiagen公司，蛋白純化試劑盒購自 Novagen 公司。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清和DMEM/High Glucose培養(yǎng)基購自Hyclone公司，兔抗綿羊IgG抗體及DAB顯色試劑購自博士德生物工程有限公司，其他試劑均購自Sigma公司。

1.2 羊IgG重鏈恒定區(qū)基因的克隆及FMDV抗原表位編碼基因的合成

按照Qiagen公司RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit(50) 使用說明從綿羊脾臟組織提取總mRNA后，進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)。首先按照 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0使用說明在PCR管中組成反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板，用特異性引物：shIgG(C)-upper:5′-CTGCCTCAACAACACCCCCGAAA-3′；shIgG(C)-lower:5′-ATTTACCCGGAGGCTTAGAGA TCGAC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min 進(jìn)行預(yù)變性；然后94 ℃ 1 min，58℃40 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。通過 RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因并將其重組于pGEM T-easy克隆載體，對所得重組體進(jìn)行酶切和PCR鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pGEM-shIgG(C)，送上海生物工程公司進(jìn)行測序鑒定。

用與上述基本相同的方法，從 AsiaⅠ Jiangsu/ China/2005 FMDV細(xì)胞適應(yīng)病毒中提取病毒基因組RNA，應(yīng)用引物 VP31:5′-CACAAATGTACAGGG ATGGGT-3′和NK61:5′-GACATGTCCTCCTGCATCT G-3′，在56℃退火條件下，通過RT-PCR擴(kuò)增得到FMDV VP1基因并將其重組于pGEM T-easy克隆載體，對所得重組體進(jìn)行酶切和PCR鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pGEM-VP1(JS)，送上海生物工程公司進(jìn)行測序鑒定。對測定結(jié)果進(jìn)行全面分析后，選擇病毒主要抗原表位基因所在區(qū)段設(shè)計(jì)出Asia ⅠF MDV 抗原表位編碼基因并送往大連寶生物工程有限公司進(jìn)行人工合成。表位基因重組于pMD19-T simple載體，并命名為pMD-F。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pGEM-shIgG(C) 為模板，應(yīng)用引物P1-EcoR I:5′-GGGAATTC GCCTCAACAACACCCC CGAAA-3′和P2-Xho I:5′-GGGCTCGAGTTTACCCG GAGGCTTAGAGATCGAC-3′通過PCR擴(kuò)增羊IgG重鏈恒定區(qū)基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后，與經(jīng)同樣酶切過的pPROEx HTb載體相連接，構(gòu)建成羊 IgG重鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pPRO-shIgG。對構(gòu)建正確的 pPRO-shIgG 應(yīng)用BamH I和EcoR I進(jìn)一步雙酶切，然后與從pMD-F質(zhì)粒上應(yīng)用同樣酶切得到的表位基因片段相連接，從而構(gòu)建得到融合表達(dá)FMDV抗原表位和羊IgG重鏈恒定區(qū)的重組質(zhì)粒pPRO-FshIgG (圖1)。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pPRO-FshIgG的構(gòu)建Fig. 1 Construction of expression plasmid pPRO-FshIgG.

1.4 蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

將鑒定為陽性并且測序確定正確的 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆并增菌后，將陽性菌在添加氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后按1%轉(zhuǎn)接到含0.06 mg/mL氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600= 0.6)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)，取各時(shí)間段 (2 h、3 h、4 h) 的表達(dá)產(chǎn)物各1 mL進(jìn)行SDS-PAGE分析。

在鑒定重組菌能夠正確高效表達(dá)后，將其進(jìn)行大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。對表達(dá)的蛋白應(yīng)用鎳離子親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，對純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。由pPRO-shIgG和 pPRO-FshIgG表達(dá)的蛋白分別命名為shIgG和FshIgG。然后應(yīng)用兔抗山羊 IgG抗體及 FMDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行Western blotting對shIgG和FshIgG進(jìn)行鑒定。

1.5 抗原制備與動物免疫

對上述純化的蛋白進(jìn)行濃度測定后，用蛋白溶解液調(diào)整蛋白液濃度為200 μg/mL。按1:1的體積比加入蛋白液和206油佐劑后用玻璃注射器反復(fù)抽吸使之完全乳化而制成免疫抗原，這樣每毫升疫苗中最終含有100 μg蛋白。

將體重在250~300 g的24只豚鼠隨機(jī)分成4組(6只/組)，第一組每只豚鼠于后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射shIgG制備抗原1 mL；第二組豚鼠注射FshIgG制備的抗原 1 mL；第三組豚鼠按推薦劑量注射商品化AsiaⅠF MDV 滅活疫苗 (購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中農(nóng)威特公司) 1 mL作為陽性對照；第四組豚鼠注射等量PBS作為陰性對照。第1次免疫后28 d對各組動物進(jìn)行第2次免疫。所有豚鼠于無FMDV的隔離環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.6 血清抗體動態(tài)監(jiān)測和中和抗體效價(jià)測定

在免疫前、免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d對豚鼠進(jìn)行心臟采血，分離血清用于抗體測定。將Asia Ⅰ型FMDV滅活抗原用ELISA包被液進(jìn)行1/8稀釋后包被ELISA反應(yīng)板后，按文獻(xiàn)報(bào)道的方法應(yīng)用間接ELISA方法測定血清中抗FMDV抗體[2]。

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上測定并用Karber法計(jì)算AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 對BHK-21細(xì)胞的半數(shù)組織感染量 (TCID50/100 μL)[3]。通過微量中和試驗(yàn)對動物免疫前、免疫后28 d和免疫后42 d采集血清中的中和抗體效價(jià)進(jìn)行檢測。將待檢血清 56℃滅活30 min后，用DMEM/High Glucose培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按50 μL進(jìn)行2倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，然后每孔中加入50 μL含有200 TCID50/ 100 μL的病毒液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h后每孔加入50 μL濃度為1×105個(gè)/mL的BHK-21細(xì)胞懸液，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后在鏡下作初步判斷，72 h用4%多聚甲醛固定30 min，用10%福爾馬林溶液配制的0.05%亞甲基藍(lán)染液染色30 min后用水沖洗，未病變細(xì)胞孔呈藍(lán)色，發(fā)生病變而細(xì)胞脫落者不著色。試驗(yàn)時(shí)設(shè)立陽性和陰性血清對照、病毒回歸試驗(yàn)對照、血清毒性對照和正常細(xì)胞對照。按照Karber法計(jì)算出能保護(hù)50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的最高血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價(jià)。

1.7 動物保護(hù)性試驗(yàn)

首先測定AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 豚鼠適應(yīng)病毒的ID50。取在?70℃、含有50%甘油PBS緩沖液中保存的含病毒豚鼠腳皮0.1 g置于研缽中，加石英砂研磨，用PBS緩沖液(pH 7.4) 制成1∶10 (W/V)的懸液，置于 4℃浸毒過夜。然后 2000 r/min離心10 min取上清，用PBS(pH 7.4) 進(jìn)行10倍系列稀釋，將10?3、10?4、10?5、10?6、10?7稀釋度的病毒液0.2 mL于豚鼠左后跖部皮內(nèi)及皮下接種，每個(gè)稀釋度接種300~350 g豚鼠4只。每24 h觀察記錄發(fā)病情況，至72 h最終判定并計(jì)算半數(shù)感染量 (ID50)[2]。

試驗(yàn)豚鼠在第 2次免疫后第 14天用上述測知ID50的AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV豚鼠適應(yīng)病毒進(jìn)行攻毒。各組的6只豚鼠左后跖部皮內(nèi)和皮下接種200倍ID50劑量的病毒液。連續(xù)觀察72 h，判定豚鼠發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 羊IgG重鏈恒定區(qū)基因的克隆

應(yīng)用 RT-PCR技術(shù)，以從綿羊脾臟中提取的總mRNA為模板擴(kuò)增到了預(yù)期大小的目的DNA片段，在電泳圖譜中可見一約 1000 bp左右的特異性條帶(圖2)。將上述擴(kuò)增到的DNA片段與克隆載體pGEM T-easy 重組后，對所得重組體應(yīng)用EcoR I酶切消化鑒定。酶切圖譜與預(yù)期一致，從重組體上切下了特異的目的基因片段。對酶切鑒定陽性的重組體pGEM-shIgG(C) 進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果表明，克隆到的基因大小為993 bp，將其與GenBank中已提交的羊IgG重鏈恒定區(qū)基因序列 (GenBank Accession No. X69797.1) 進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，克隆到的羊IgG重鏈恒定區(qū)基因序列與該序列的相似性高達(dá)99%以上。以上基本說明所克隆羊IgG重鏈恒定區(qū)基因序列的正確性。

以AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 細(xì)胞適應(yīng)病毒中提取的病毒基因組RNA為模板，應(yīng)用引物VP31和NK61擴(kuò)增得到一約800 bp的DNA片段。該DNA重組于pGEM T-easy克隆載體后，對用酶切和PCR方法鑒定為陽性質(zhì)粒命名為pGEM-VP1(JS) 送上海生物工程公司進(jìn)行測序鑒定。結(jié)果表明，所克隆到的基因完整涵蓋了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因片段，將其與國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室已公布的該毒株的基因序列 (GenBank Accession No. EF149009.1) 比較發(fā)現(xiàn)，兩者的相似性為100%。

圖2 羊IgG重鏈恒定區(qū)基因的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene.

圖3 FMDV VP1基因的PCR擴(kuò)增Fig. 3 PCR product of FMDV VP1 gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of FMDV VP1 gene.

2.2 FMDV抗原表位基因的設(shè)計(jì)、化學(xué)合成

根據(jù)上述所克隆并測定的 AsiaⅠ Jiangsu/China/ 2005 FMDV株FMDV VP1基因序列，選擇VP1的136~160aa及198~211aa位氨基酸肽段，將其應(yīng)用-G GSSGG-這一短肽連接組成 136~160aa-GGSSGG-198~211aa-GGSSGG-136~160aa-GGSSGG-198~ 211aa重復(fù)串聯(lián)形式 (圖4)。對該重復(fù)串聯(lián)肽段的編碼基因進(jìn)行人工化學(xué)合成，在其基因的5′端和3′端分別依次引入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，并將其與 pMD19-T simple 載體重組，重組體命名為pMD-F。該表位肽編碼基因大小為288 bp，共編碼96個(gè)氨基酸。

圖4 Asia I型FMDV抗原表位的設(shè)計(jì)Fig. 4 Epitope design of type Asia I FMDV.

2.3 蛋白表達(dá)、純化和鑒定

應(yīng)用 SDS-PAGE檢測轉(zhuǎn)化 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG的重組大腸桿菌表達(dá)蛋白的情況。電泳圖譜顯示，重組菌在1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下分別高效表達(dá)了一個(gè)40 kDa左右和45 kDa的蛋白，大小與預(yù)期目的蛋白大小相符。表達(dá)的蛋白應(yīng)用鎳離子親和層析技術(shù)進(jìn)行了純化，純化蛋白的純度可達(dá)80%以上 (圖5)。最后對純化的蛋白應(yīng)用Western blotting技術(shù)進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化所得的shIgG蛋白能夠和標(biāo)準(zhǔn)兔抗綿羊IgG抗體呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而FshIgG蛋白則同時(shí)能夠與兔抗綿羊IgG抗體和豚鼠抗FMDV的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng) (圖6)。

2.4 血清抗體的測定

將所表達(dá)的蛋白shIgG和FshIgG乳化制備成疫苗以后免疫豚鼠，應(yīng)用間接ELISA方法測定血清抗體。結(jié)果表明，F(xiàn)shIgG蛋白制成的疫苗免疫的豚鼠在免疫后 7 d就可以檢測到特異性抗體，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中，該組動物的抗體水平一直呈持續(xù)增高的趨勢。二免后抗體水平有所提高。商品化的滅活疫苗免疫動物在免疫以后則迅速產(chǎn)生抗FMDV的特異性抗體，免疫21 d后就能達(dá)到很高的抗體水平，第二次免疫對該組豚鼠抗體水平未見顯著影響。作為陰性對照的應(yīng)用shIgG蛋白和PBS免疫的豚鼠，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中始終檢測不到特異性抗體 (圖7)。

2.5 血清中和抗體效價(jià)的測定

圖5 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed protein. 1: induced BL21(DE3) control; 2: induced pPROEx HTb/BL21(DE3) control; 3: protein marker; 4: uninduced pPRO-shIgG/ BL21(DE3) control; 5: induced product of pPRO-shIgG/ BL21(DE3); 6: purified product of shIgG; 7: uninduced pPRO-FshIgG/BL21(DE3) control; 8: induced product of pPRO-FshIgG/BL21(DE3); 9: purified product of FshIgG.

圖6 shIgG和FshIgG的Western blotting分析Fig. 6 Western blotting analysis of shIgG and FshIgG protein. 1: shIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody; 2: shIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody; 3: FshIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody；4: FshIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody.

用病毒微量中和試驗(yàn)對各實(shí)驗(yàn)組豚鼠在免疫前(0 d)、二免前 (28 d) 及攻毒前 (42 d) 所采集血清中 FMDV的中和抗體效價(jià)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，F(xiàn)shIgG蛋白免疫豚鼠的血清中能夠檢測到較高效價(jià)的中和抗體。特別是在二免后兩周進(jìn)行攻毒時(shí)，其中和抗體效價(jià)基本達(dá)到了滅活疫苗免疫組動物的抗體水平 (圖8)。

2.6 豚鼠攻毒試驗(yàn)

不同稀釋度的適應(yīng)豚鼠的 Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV 液0.2 mL接種豚鼠后，豚鼠的發(fā)病情況表明 (表1)，該病毒的ID50應(yīng)在10?5和10?6之間，按Karber法計(jì)算其準(zhǔn)確的ID50: lgID50=L?d(s?0.5)，其中，L=最高稀釋度的對數(shù)；d=稀釋度對數(shù)之差；s=發(fā)病率之和[3]。那么，該病毒的 ID50/0.2 mL為10?5.5。

圖7 免疫豚鼠的抗體水平檢測Fig. 7 Antibody level of guinea pigs post vaccination.

圖8 免疫豚鼠的中和抗體效價(jià)檢測Fig. 8 Neutralizing antibody titres of guinea pigs.

表1 Asia ⅠJiangsu/China/2005 FMDV ID50的測定Table 1 Identification of ID50 for Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV

用上述測定ID50的Asia I型FMDV對所有免疫豚鼠進(jìn)行攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用FshIgG免疫的6只豚鼠與用商品化滅活疫苗免疫豚鼠一樣，所有豚鼠都未發(fā)病，而作為對照組的用PBS和用shIgG免疫的豚鼠則全部發(fā)病 (表2)。表明FshIgG蛋白免疫豚鼠后能夠給豚鼠提供一定的保護(hù)力，使得動物能夠抵御FMDV感染。

表2 免疫豚鼠抗病毒能力檢測Table 2 Protection of immunized guinea pigs from viral challenge

3 討論

口蹄疫表位疫苗的研究起步很早，早在 1981年，Kleid等首次在大腸桿菌中成功表達(dá)FMDV A12株VP1重組蛋白抗原，并進(jìn)行了免疫原性的研究分析，結(jié)果顯示，重組蛋白抗原能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，免疫動物能夠抵御同源病毒的攻擊，說明VP1蛋白是 FMDV重要的保護(hù)性抗原，這為口蹄疫表位疫苗的研制提供了依據(jù)[4]。1982年，Bittle等首次報(bào)道了用化學(xué)合成的 FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白C端141~160aa短肽，免疫動物后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并能抵御同源FMDV的攻擊[5]。這一成果成為口蹄疫乃至整個(gè)動物疫病表位肽疫苗研究的開端。

過去的大量研究已經(jīng)表明，O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141~160aa和200~213aa是病毒的兩個(gè)優(yōu)勢中和表位，很多研究都在應(yīng)用這兩個(gè)抗原表位進(jìn)行O型FMDV表位疫苗的研究，并取得了很好的免疫效果[6-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了Asia I型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上與O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上141~160aa位和200~213aa相對應(yīng)的肽段136~160aa和 198~211aa作為抗原表位，將其進(jìn)行了重復(fù)串聯(lián)后對其基因進(jìn)行了人工合成。

但是，僅由抗原表位組成的FMDV表位疫苗并不能給動物提供完全保護(hù)。究其原因，人們普遍認(rèn)為由于表位多肽分子量小，易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，不能夠作為良好的免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，所以為克服表位肽單獨(dú)存在時(shí)免疫原性低的現(xiàn)象，人們常將表位肽與某些蛋白分子偶聯(lián)來增強(qiáng)其免疫原性。這些蛋白分子常被稱為表位載體分子，它們對于免疫動物可以是外源性的，也可以是宿主自身的某些蛋白分子。作為表位載體蛋白的外源性蛋白主要有 BSA[9]、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)[10-11]、霍亂毒素、谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 (GST) 和匙孔血藍(lán)蛋白[12]等。這些外源載體蛋白能夠增強(qiáng)表位抗原的免疫原性，延長小分子表位抗原在機(jī)體內(nèi)的降解半衰期。但載體蛋白對機(jī)體來說是一種外源抗原，機(jī)體會產(chǎn)生針對載體分子的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可能在一定程度上分散了機(jī)體針對疫苗表位的免疫應(yīng)答能力，從而導(dǎo)致疫苗免疫效果不夠理想。國內(nèi)外學(xué)者利用機(jī)體免疫系統(tǒng)不對自身物質(zhì)發(fā)生免疫應(yīng)答這一特點(diǎn)，將口蹄疫病毒VP1蛋白上的若干表位基因串聯(lián)后與豬免疫球蛋白IgG重鏈恒定區(qū)基因融合，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白。利用該蛋白免疫豬后的動物保護(hù)性試驗(yàn)顯示，多表位重組蛋白疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，其不僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體，也能有效地誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且免疫豬能夠抵御50~100 ID50劑量的同源毒攻擊，獲得100%保護(hù)[13-14]。這在一定程度上顯示了動物自身 IgG重鏈恒定區(qū)蛋白作為表位載體蛋白的優(yōu)越性。

該研究中將上述所設(shè)計(jì)的表位與綿羊IgG重鏈恒定區(qū)基因串聯(lián)后在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)，得到了Asia I型FMDV抗原表位偶聯(lián)于綿羊IgG重鏈恒定區(qū)蛋白 N端所形成的融合蛋白 FshIgG。將100 μg FshIgG融合蛋白與206油佐劑混合乳化后免疫豚鼠，在免疫后2周應(yīng)用間接ELISA方法檢測到了針對FMDV的特異性抗體。在二免以后2周，用200倍 ID50的病毒劑量對免疫豚鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FshIgG免疫組的豚鼠全部得到了保護(hù)。這些結(jié)果充分地說明FshIgG蛋白具有良好的抗原性，該蛋白不但能夠與標(biāo)準(zhǔn)的FMDV陽性血清特異性反應(yīng)，而且能夠在動物機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對FMDV的特異性的抗體。雖然從 FshIgG免疫組豚鼠血清中FMDV抗體的檢測結(jié)果來看，抗體水平達(dá)不到傳統(tǒng)滅活疫苗所誘導(dǎo)的抗體水平，但是卻能夠提供與滅活疫苗相同的免疫保護(hù)。這可能與各自所誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的中和性和親和力有關(guān)系。所以通過病毒微量中和試驗(yàn)對疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，F(xiàn)shIgG蛋白疫苗2次免疫動物以后，動物血清中的中和抗體效價(jià)可達(dá)10?2.8，基本與滅活疫苗免疫組豚鼠血清中和抗體水平一致。此外，本實(shí)驗(yàn)中之所以應(yīng)用綿羊IgG重鏈恒定區(qū)蛋白作為抗原表位的載體，構(gòu)建能夠應(yīng)用于綿羊的FMDV表位疫苗的候選抗原，是因?yàn)榫d羊在感染FMDV后的發(fā)病率相對較低、臨床癥狀不明顯，易被忽略，從而攜帶病毒成為長期的傳染源，其素有病原的“貯存器”之說。所以通過疫苗免疫提高羊群整體的FMDV免疫水平顯得尤為重要。雖然以綿羊IgG重鏈恒定區(qū)蛋白作為抗原表位的載體的優(yōu)越性和該抗原在綿羊的免疫效果還需進(jìn)一步的試驗(yàn)來評價(jià)，但本實(shí)驗(yàn)的完成為進(jìn)一步研制綿羊的FMDV表位疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。

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