郭艷梅，鄭平，孫際賓

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

1 概述

黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，其分生孢子頭呈褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗 (圖 1)，多見于糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。黑曲霉又是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，在工業(yè)酶制劑、有機(jī)酸發(fā)酵方面應(yīng)用廣泛。可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等超過30種酶制劑。因?yàn)楹谇钩錾牡鞍踪|(zhì)分泌能力，黑曲霉也被開發(fā)為通用的異源蛋白表達(dá)載體。黑曲霉是檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的主要生產(chǎn)菌。世界上檸檬酸年產(chǎn)量超過150萬t，其中 99%以上的檸檬酸都是通過黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的，中國檸檬酸生產(chǎn)的技術(shù)和產(chǎn)能都居世界領(lǐng)先地位。另外黑曲霉在甾體轉(zhuǎn)化、傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀制等方面也有所應(yīng)用。

圖1 黑曲霉分生孢子梗的掃描電鏡圖[1] (本圖由愛丁堡大學(xué)瑞德博士惠供)Fig. 1 Scanning electron microscope photo of Aspergillus niger conidial head[1] (with kindly permission from Dr. Nick Read).

黑曲霉具有強(qiáng)大的聚合物降解酶系，賦予其在各種廉價(jià)的培養(yǎng)基上快速生長和發(fā)酵的能力，能夠在極低的pH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能夠適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵中粗放的物料和理化環(huán)境，這些品質(zhì)使黑曲霉成為一種不可多得的工業(yè)生產(chǎn)宿主菌，即細(xì)胞工廠。但追溯起來，是黑曲霉在檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用首先奠定了其在工業(yè)發(fā)酵上的特殊地位。早在1923年黑曲霉就已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸。到目前為止，利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵過程已經(jīng)成為微生物發(fā)酵工業(yè)的典范。在近一個世紀(jì)的檸檬酸生產(chǎn)過程中，檸檬酸生產(chǎn)的各項(xiàng)性能指標(biāo)突飛猛進(jìn)，黑曲霉菌種改造是主要推手，但這其中仍以傳統(tǒng)的誘變育種為主。

自上世紀(jì)90年代以來，分子生物學(xué)的進(jìn)步率先揭開了全面研究黑曲霉細(xì)胞工廠運(yùn)作機(jī)制的序幕。一些基因得到克隆和功能表征，一些針對絲狀真菌的分子生物學(xué)操作技術(shù)也在黑曲霉中得到實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用，如敲除載體、轉(zhuǎn)化方法、篩選標(biāo)記等等。這些都為更好地研究黑曲霉的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2007年前后，3株黑曲霉菌株基因組的公布，將黑曲霉的研究推入后基因組時代。伴隨著分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展，黑曲霉這個高效運(yùn)作的細(xì)胞工廠的神秘面紗正在被逐漸揭開，對黑曲霉細(xì)胞工廠進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化的能力正在逐步形成。

2 系統(tǒng)生物學(xué)的進(jìn)步使得對黑曲霉的了解一步步深入

2.1 黑曲霉基因組

近年來，有3株黑曲霉工業(yè)菌株先后獲得測序。2000年7月荷蘭帝斯曼公司 (DSM) 率先啟動了對其擁有的工業(yè)酶生產(chǎn)菌株黑曲霉CBS 513.88的測序計(jì)劃。采用BAC和shotgun法，2001年底完成測序，8倍覆蓋率，拼接成約500個重疊群 (Contigs)，大小34.5兆堿基對，預(yù)測有14 000多個基因，但該信息當(dāng)時僅限于在公司內(nèi)部使用。大約與此同時，美國 Integrated Genomics 公司完成對黑曲霉菌株ATCC 9029測序，該菌株曾被用于多種酶制劑和有機(jī)酸生產(chǎn)的研究。測序采用shotgun法，4倍覆蓋率，約10 000個重疊群。形成的數(shù)據(jù)庫通過該公司的生物信息集成數(shù)據(jù)庫ERGO進(jìn)行銷售。2006年美國能源部聯(lián)合基因組學(xué)研究所 (JGI) 完成對檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉ATCC 1015測序，測序質(zhì)量與帝斯曼的質(zhì)量相當(dāng)，也是8倍覆蓋率?；蚪M大小為37.1兆，較帝斯曼菌株大，預(yù)測基因數(shù)目約 11 000個。JGI采取的是開放策略，其數(shù)據(jù)在公開發(fā)表之前已經(jīng)提供給公眾下載[2](http://genome.jgi-psf.org/Aspni1/ Aspni1.home.html)。在這種形勢下，在對其菌株基因組信息進(jìn)行了充分的挖掘和專利保護(hù)之后，帝斯曼公司及其合作伙伴在Nature Biotechnology上發(fā)表論文[3]，對黑曲霉基因組進(jìn)行系統(tǒng)闡述，并公布序列和高質(zhì)量的基因組注釋。同時發(fā)表的還有對其中央代謝途徑的重建和對其蛋白質(zhì)分泌途徑的解析，成為當(dāng)時黑曲霉研究領(lǐng)域，特別是在歐洲的企業(yè)界和學(xué)術(shù)界研究者與生物信息工作者聯(lián)手合作的典范，轟動了當(dāng)時的學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界。本文作者有幸參與了這一工作，在重建黑曲霉分泌途徑方面做了一點(diǎn)工作。

黑曲霉基因組數(shù)據(jù)的公布為功能基因組學(xué)的深入研究奠定了基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組方面的數(shù)據(jù)很快得到了發(fā)表，使細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和代謝工程研究變得更加便捷，也為通過工程手段提高工業(yè)生產(chǎn)菌株性能提供了新的思路和方法。

2.2 蛋白質(zhì)分泌途徑

黑曲霉具有高效表達(dá)和分泌某些蛋白質(zhì)、特別是各種水解酶的能力，但是并非所有異源蛋白都能夠通過黑曲霉實(shí)現(xiàn)過量胞外生產(chǎn)。雖然通過一些技術(shù)手段，例如采用基因融合、蛋白酶缺失、分子伴侶和折疊酶過量表達(dá)等工程菌株改造策略，在某些情況下可以提高一些異源蛋白的產(chǎn)量，但是在很多情況下仍難以奏效。蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制和其改造是異源蛋白生產(chǎn)的瓶頸問題。

真核生物胞外蛋白質(zhì)的分泌是一個非常復(fù)雜的過程。分泌蛋白通常在N端有信號肽序列，它引導(dǎo)分泌蛋白定位于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的核糖體上合成，隨后信號肽被切除，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行加工、修飾；然后被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中進(jìn)行進(jìn)一步的翻譯后加工，形成有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)；最后通過高爾基體發(fā)生的分泌小泡與質(zhì)膜融合，將其包含的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，這個過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體 (ER-Golgi) 蛋白分泌途徑 (圖2)。

圖2 黑曲霉的蛋白質(zhì)分泌途徑[3] (括號中的數(shù)字表示涉及該過程的編碼基因數(shù)量)Fig. 2 Protein secretory pathway of Aspergillus niger[3]. The numbers in parentheses represent the number of coding genes involved in the corresponding process.

通過比較黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、脈胞霉、釀酒酵母等20余種真核生物，我們第一次注釋了與黑曲霉蛋白質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的 300多個基因，約占其基因組總量的2%，初步重建了黑曲霉的蛋白質(zhì)分泌途徑[3]。與其他真核生物相比，黑曲霉表現(xiàn)了與眾不同的特點(diǎn)，比如具有更多的糖基化基因，具有與細(xì)菌類似的IbpA蛋白穩(wěn)定蛋白質(zhì)分散，更多的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和肽基脯氨酰異構(gòu)酶幫助蛋白質(zhì)折疊，與哺乳動物和酵母菌都不同的未折疊蛋白響應(yīng)系統(tǒng)(UPR) 等。

2.3 代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

在廣泛的基因組注釋和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，孫際賓等重建了黑曲霉基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型[4](圖3)，共涉及4 000多個基因，999個不同的酶序列號 (EC number)，2 443個代謝反應(yīng)和2 349個代謝產(chǎn)物。這是黑曲霉第一個全面的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，是以往文獻(xiàn)發(fā)表的黑曲霉網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)數(shù)目的 8倍以上。應(yīng)用此網(wǎng)絡(luò)模型首先分析了黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸的機(jī)理[4]。發(fā)現(xiàn)黑曲霉除了豐富的多糖水解酶體系外，其糖酵解和三羧酸循環(huán)還有豐富的冗余基因，即較多的重復(fù)基因拷貝編碼催化同一步反應(yīng)的酶。典型的是檸檬酸合成酶CS和線粒體支鏈氧化還原酶AOX。與當(dāng)時基因組序列已經(jīng)公布的絲狀真菌相比，3株獲得測序的黑曲霉菌株普遍存在額外的第 5套檸檬酸合成酶，而檸檬酸生產(chǎn)菌株ATCC 1015則具有第 6套細(xì)菌來源的檸檬酸合成酶。在檸檬酸的合成過程中，氧氣被同時大量消耗。發(fā)酵過程停止通氣5 min足以導(dǎo)致整個發(fā)酵過程發(fā)生不可逆的損傷。究其原因，黑曲霉轉(zhuǎn)化葡萄糖生成檸檬酸的過程中，每一分子檸檬酸的合成，都會伴隨3分子NADH的產(chǎn)生。大量的NADH只有傳遞給氧氣才能得到氧化再生。除氧化磷酸化電子傳遞鏈外，黑曲霉被認(rèn)為擁有一條不產(chǎn)生能量的電子傳遞系統(tǒng)，稱為支鏈氧化還原酶AOX。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 AOX系統(tǒng)經(jīng)過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明與檸檬酸高速合成無關(guān)，其同源系統(tǒng)在所有真核生物中有著廣泛的分布。非常有趣的是，通過基因組分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉存在另外一套獨(dú)有的AOX，稱之為AOX2。這一發(fā)現(xiàn)，為解釋NADH高速循環(huán)和檸檬酸快速合成提供了新的思路，也為黑曲霉細(xì)胞工廠的重新設(shè)計(jì)指出了途徑。

圖3 黑曲霉基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型[4]Fig. 3 Genome-scale metabolic network of Aspergillus niger[4].

在黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)研究方面的一個里程碑是Jens Nielsen小組2008年發(fā)表在Molecular Systems Biology[5]上的工作在深入分析文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，他們建立了包括亞細(xì)胞定位和運(yùn)輸反應(yīng)的全細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，包含文獻(xiàn)371篇，生化反應(yīng)1 190個。結(jié)合文獻(xiàn)中的宏觀數(shù)據(jù)、流量分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，他們證實(shí)了其網(wǎng)絡(luò)的可靠性，分析了黑曲霉的代謝潛力。與前面介紹的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)相比，盡管反應(yīng)總數(shù)少一半左右，但是可靠性有很大提升，同時包含亞細(xì)胞定位和運(yùn)輸反應(yīng)，這些信息對于模型模擬與細(xì)胞仿真非常重要。在 Nielsen等的基礎(chǔ)上補(bǔ)充更多的可靠的代謝反應(yīng)，是黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)研究的重要方向，將成為黑曲霉細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)的重要基礎(chǔ)。

2.4 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

盡管對黑曲霉的研究有近百年的歷史，在PUBMED中可索引的文獻(xiàn)有數(shù)千條，但是限于其遺傳操作的復(fù)雜性，關(guān)于黑曲霉基因調(diào)控的機(jī)理的研究非常少。這種狀態(tài)一直到2007年黑曲霉基因組序列得以公開后才開始改變。Park等構(gòu)建了真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 (http://ftfd.snu.ac.kr)，從 156個真菌的全基因組數(shù)據(jù)預(yù)測了58 890個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，包括黑曲霉CBS 513.88的679個轉(zhuǎn)錄因子，為從構(gòu)建全基因組規(guī)模調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了條件。通過對 3 000余篇黑曲霉相關(guān)研究論文的分析總結(jié)，我們匯總了文獻(xiàn)中對黑曲霉基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的成果，得到經(jīng)實(shí)驗(yàn)確證了的調(diào)控蛋白和其調(diào)控關(guān)系，同時通過各種計(jì)算生物學(xué)手段預(yù)測新的調(diào)控，初步形成了黑曲霉基因調(diào)控網(wǎng)路和數(shù)據(jù)庫。同時我們在積極開展高通量的蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究，期望在不遠(yuǎn)的將來，進(jìn)一步拓展對黑曲霉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。

2.5 黑曲霉的系統(tǒng)解析

高通量系統(tǒng)生物學(xué)分析是理解黑曲霉細(xì)胞工廠的重要基礎(chǔ)，特別是近幾年來，隨著黑曲霉基因組的發(fā)布，相關(guān)研究呈現(xiàn)井噴趨勢。甚至在基因組數(shù)據(jù)正式公布之前，Semova等就于2006年率先發(fā)表了在 7種不同培養(yǎng)條件下的 EST (Expressed sequence tags) 數(shù)據(jù)，包括12 820個EST序列，分屬于5 108個基因模型[6]。Meyer等首次通過基因芯片技術(shù)分析了在存在抗真菌藥物環(huán)境下黑曲霉的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)[7]。Nielsen研究組發(fā)布了黑曲霉、構(gòu)巢曲霉和米曲霉的三基因組整合型芯片，Affymetrix格式，方便了 3種曲霉的比較分析[8]。他們利用此芯片比較研究了3種曲霉在葡萄糖和甘油兩種碳源上基因轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)了一個重要調(diào)控因子Adr1和其保守DNA結(jié)合序列，表明在曲霉屬、甚至在釀酒酵母和人類中，該調(diào)控模式都是相當(dāng)保守的[9]。

Lu等 2007年就通過二維電泳完成了淀粉酶產(chǎn)生菌黑曲霉在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下 (分別以麥芽糖和木糖為碳源) 的蛋白質(zhì)組的比較研究，但是相關(guān)工作直到2010年才發(fā)表[10]。研究表明在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下胞漿蛋白質(zhì)組并沒有明顯的差異，主要差異體現(xiàn)在胞外分泌蛋白，特別是植物細(xì)胞壁降解蛋白。最近 J?rgensen等作了類似條件下的轉(zhuǎn)錄組比較，但是實(shí)驗(yàn)是在控制更精確的恒化培養(yǎng)條件下完成的。他們發(fā)現(xiàn)在此條件下以麥芽糖為唯一碳源時胞外蛋白量是以木糖為唯一碳源的3倍以上，90種以上與蛋白質(zhì)分泌途徑有關(guān)的蛋白發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，包括蛋白質(zhì) ER轉(zhuǎn)位、折疊、糖基化、質(zhì)量控制、小體裝配和運(yùn)輸?shù)?，與未折疊蛋白響應(yīng)UPR的情況非常類似[11]。荷蘭帝斯曼公司比較研究了3種胞外酶生產(chǎn)菌株及其野生型菌株在蛋白質(zhì)生產(chǎn)條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組方面的差異[12]。他們發(fā)現(xiàn)隨著產(chǎn)量和產(chǎn)物性質(zhì)的不同，細(xì)胞的響應(yīng)存在顯著差異，如碳氮代謝、氧化壓力蛋白、蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng) (ERAD) 等。通過在β-葡萄糖苷酸酶 (GUS) 高產(chǎn)菌株中過量表達(dá) ERAD因子doaA和寡糖轉(zhuǎn)移酶sttC，GUS的產(chǎn)量確實(shí)得到了少量提升。Oliveira等最近通過LC-MS/MS研究了胞外分泌小體 microsome中蛋白質(zhì)的分布情況，也發(fā)現(xiàn)在小體中存在ERAD組分Cdc48，并且首次發(fā)現(xiàn)小體中含有14種蛋白體20S亞基組分[13]。

3 構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工廠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)儲備

遺傳操作系統(tǒng)是基因功能分析和細(xì)胞工廠改造的必需工具。隨著黑曲霉基因組序列的公布，其遺傳操作系統(tǒng)的研究進(jìn)展十分迅速。

基因敲除是遺傳操作中的難點(diǎn)和關(guān)鍵，是基因功能研究和細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)中的常用手段。雖然基因敲除目前在細(xì)菌、酵母及哺乳動物中已有廣泛應(yīng)用，但對于絲狀真菌還存在一些技術(shù)問題阻礙其應(yīng)用。主要包括：克隆和篩選步驟繁瑣，獲得所需打靶載體費(fèi)時費(fèi)力；絲狀真菌基因敲除通常需要較長的同源序列；一般在絲狀真菌中發(fā)生同源重組的頻率低，打靶效率低。同源重組的頻率主要受打靶載體同源序列的長度、載體構(gòu)型、打靶位點(diǎn)和菌株等因素的影響。針對上述問題，近年來研究者提出了許多有效的改進(jìn)措施，在黑曲霉中已經(jīng)建立了高效打靶系統(tǒng)，這使得黑曲霉的遺傳操作變得簡便、迅速和高效，為黑曲霉的深入研究和應(yīng)用鋪平了道路。

3.1 基因打靶系統(tǒng)

在進(jìn)行目的基因敲除過程中，載體構(gòu)建非常重要。載體一般要包括 2個分別與目標(biāo)基因兩側(cè)同源的臂序列和 1個篩選標(biāo)記基因。在絲狀真菌中進(jìn)行基因替換通常需要500 bp或更長的同源臂序列[14]。融合PCR法是一種新的用于絲狀真菌打靶載體快速構(gòu)建的方法，通過三輪 PCR可直接獲得三片段的融合產(chǎn)物。首先利用融合 PCR實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因替換的是構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans (Eidam) Winter、煙曲霉 A. fumigatus Fres.及禾谷鐮刀菌 Fusarium graminearum Schw.等。

利用在大腸桿菌中表達(dá)的 Lambda噬菌體的Red系統(tǒng) (gam，bet，exo) 構(gòu)建置換型打靶載體是一種獲得大片段同源臂的有效方法，該方法已成功地用于構(gòu)巢曲霉基因的敲除[15]。步驟包括：從基因組文庫中得到含有曲霉目標(biāo)基因及其鄰近基因的cosmid；擴(kuò)增帶有大腸桿菌/真菌雙重篩選標(biāo)記的PCR片段，兩端各有50 bp左右與目標(biāo)基因同源的序列；在大腸桿菌中借助Lambda噬菌體的Red系統(tǒng)用篩選標(biāo)記替換cosmid上的待敲除基因，從而獲得帶有大片段同源序列 (目標(biāo)基因的鄰近基因) 的重組cosmid；將此重組載體導(dǎo)入構(gòu)巢曲霉中，由于其同源臂很長所以大大提高了同源重組的效率。

轉(zhuǎn)座子隊(duì)列敲除 (Transposon-arrayed gene knockout，TAGKO) 可以用于多個目標(biāo)基因替換載體的構(gòu)建。該方法首先構(gòu)建真菌cosmid基因組文庫，篩選含有目標(biāo)基因的cosmid。通過轉(zhuǎn)座酶的酶促反應(yīng)，攜帶篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子Tn7隨機(jī)整合入cosmid，破壞其中的基因。帶有被轉(zhuǎn)座子破壞的基因的cosmid可直接作為目標(biāo)載體通過原生質(zhì)體或孢子電擊轉(zhuǎn)化，對染色體上的基因進(jìn)行置換。TAGKO可以誘導(dǎo)高頻率目標(biāo)基因替換的原因可能是該方法構(gòu)建的打靶載體通常含有較長的同源序列 (約40 kb)。該方法亦是發(fā)現(xiàn)新基因及對基因功能進(jìn)行分析的有效方法。

在真核生物細(xì)胞內(nèi)存在兩種 DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制：一種是同源重組 (Homologous recombination，HR)，一種是非同源末端結(jié)合 (Non-homologous End Joining，NHEJ)?；蚯贸饕抢昧送粗亟M (HR) 的原理。非同源末端連接 (NHEJ) 是真核生物細(xì)胞在不依賴DNA同源性的情況下，為了避免因DNA或染色體斷裂造成的DNA降解或?qū)ιΦ挠绊?，?qiáng)行將2個DNA斷端彼此連接在一起的一種特殊的修復(fù)機(jī)制。這一途徑的存在使得打靶載體被隨機(jī)整合到染色體上，從而大大降低了同源重組子的獲得頻率。在哺乳動物中 NHEJ途徑占據(jù)主導(dǎo)地位，而在酵母細(xì)胞中則主要由 HR途徑修復(fù)。現(xiàn)已確定在絲狀真菌中NHEJ占主導(dǎo)地位，這也是為什么在黑曲霉等絲狀真菌中難以實(shí)現(xiàn)定向遺傳操作的原因。Ku70和Ku80是NHEJ途徑中的核心因子，如果將其敲除則 NHEJ途徑被破壞，那么此時 HR途徑將占據(jù)主導(dǎo)地位，從而大大提高同源重組的效率。自從2004年Ninomiya等[16]成功地將粗糙鏈孢霉中的Ku70和Ku80敲除而實(shí)現(xiàn)了同源重組效率的大幅提升后，這項(xiàng)方法很快被應(yīng)用到構(gòu)巢曲霉[17]、黑曲霉[7]、米曲霉[18-19]、醬油曲霉[18-19]中。黑曲霉敲除Ku70及 (或) Ku80后可以實(shí)現(xiàn)近乎100%的同源重組率，而野生型僅為10%~30%。

Khang等開發(fā)了針對絲狀真菌的正反雙重篩選體系[20]，正選擇標(biāo)記可以篩選出發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子，反選擇標(biāo)記排除發(fā)生非同源重組的轉(zhuǎn)化子，其應(yīng)用大大提高了同源重組突變體篩選的效率。這種方法中用到的反選擇標(biāo)記是皰疹單純病毒胸苷激酶(Herpes simplexvirus thymidine kinase，HSVtk)，可以將核苷類似物 5-fluoro-2-deoxyuridine (F2dU) 轉(zhuǎn)化為一種真菌毒性化合物。將HSVtk 基因置于載體目標(biāo)基因同源區(qū)的外側(cè)，異位插入的轉(zhuǎn)化子因無法發(fā)生第2次同源重組因而攜帶該基因，在F2dU 存在的情況下無法存活；而同源突變體因發(fā)生第 2次同源重組而去除了HSVtk 基因，可以在F2dU篩選平板上形成菌落。通過上述雙重篩選體系獲得的轉(zhuǎn)化子理論上就是目標(biāo)突變體。

在構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工廠時，因?yàn)橐贸?改變多個位點(diǎn)，篩選標(biāo)記不能留在染色體上，因此實(shí)現(xiàn)無痕敲除非常重要。我們參照在細(xì)菌中廣泛應(yīng)用的基于反向篩選的敲除策略，提出了在黑曲霉中實(shí)現(xiàn)無痕敲除的策略 (圖 4)。將要敲除的目標(biāo)基因的左右臂連接，正向與反向篩選標(biāo)記串聯(lián)置于其一側(cè)。第1次重組的過程中利用正向篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選 (圖4A)，第2次重組則利用反向篩選標(biāo)記篩選。第2次重組后會出現(xiàn)兩種情況：一種為重組出現(xiàn)在預(yù)定位置，基因敲除成功 (圖4B)。第二種情況為二次交換仍在第一次交換時的位置進(jìn)行，則二次重組恢復(fù)成野生型 (圖4C)。而異位插入的情況則較好排除，因?yàn)樵谥滤阑虼嬖谙绿砑酉鄳?yīng)底物會使異位插入轉(zhuǎn)化子致死。

3.2 黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化

黑曲霉具有較高的蛋白質(zhì)分泌能力、與高等真核生物類似的翻譯后加工能力、成熟的發(fā)酵工藝和生物安全性等優(yōu)點(diǎn)，因而成為新一代微生物高效表達(dá)分泌系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。對黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化改良的工作包括選用強(qiáng)啟動子、增加基因拷貝數(shù)、構(gòu)建蛋白酶缺陷突變株、進(jìn)行基因融合等。

圖4 一種黑曲霉無痕敲除策略原理Fig. 4 A proposed strategy for scarless gene knockout in Aspergillus niger.

3.2.1 強(qiáng)啟動子

利用強(qiáng)啟動子增加外源基因在黑曲霉中的表達(dá)是一種最為常見的分子操作手段。在黑曲霉中獲得應(yīng)用的強(qiáng)啟動子一般來自于絲狀真菌高效表達(dá)的基因，常用的比如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉自身的編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因 (Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，gpdA) 的啟動子[21-22]、黑曲霉糖酵解途徑組成型丙酮酸激酶基因 (Constitutive glycolytic pyruvate kinase，pkiA) 的強(qiáng)啟動子[23-24]等。將目標(biāo)基因與強(qiáng)啟動子偶聯(lián)，轉(zhuǎn)化黑曲霉從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的高效表達(dá)。Liu等[25]將黑曲霉糖化酶基因上游激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以多重拷貝的形式插入一個表達(dá)型質(zhì)粒的啟動子區(qū)，改造后的啟動子大大提高了外源基因的表達(dá)水平。

3.2.2 增加基因拷貝數(shù)

增加外源基因在絲狀真菌中的拷貝數(shù)，能顯著增加重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。江南大學(xué)王正祥研究組發(fā)現(xiàn)，在黑曲霉染色體整合2~3倍糖化酶基因時，糖化酶的合成量比野生型提高了17.5%[26]。

3.2.3 利用蛋白酶缺陷菌株

黑曲霉自身能產(chǎn)生一些胞內(nèi)或胞外蛋白酶，能導(dǎo)致過量表達(dá)的目標(biāo)蛋白的降解。為了克服這一困難，往往采用遺傳誘變或插入失活的方法得到一些蛋白酶缺陷的黑曲霉。劉麗等[27]通過紫外誘變得到一株胞外酸性蛋白酶活力僅為原株 0.76%的菌株。其生長特性和產(chǎn)糖化酶活力與原株基本一致，但報(bào)告基因VHb的分泌表達(dá)水平卻遠(yuǎn)高于原始菌株，由此證明酸性蛋白酶缺陷對保護(hù)外源蛋白產(chǎn)生了顯著效果。

3.2.4 基因融合

為了提高目標(biāo)基因的分泌表達(dá)率，防止表達(dá)蛋白被降解，在黑曲霉中也常采用基因融合的方法，即把一個在黑曲霉中能高效表達(dá)的基因截短然后與目標(biāo)基因首尾相連構(gòu)建表達(dá)載體，在黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白可以增加表達(dá)蛋白的可溶性，有利于蛋白的純化。Karnaukhova等[28]將人類的 α蛋白酶抑制因子 (Alpha1-PI) 與黑曲霉中能夠高效表達(dá)分泌的葡糖淀粉酶G2 (Glucoamylase G2) 相融合，從而將這種原本只能極微量獲得的抑制因子產(chǎn)量大大提高，其分泌的有活性的融合蛋白達(dá)到12 mg/L。

3.3 篩選標(biāo)記

遺傳轉(zhuǎn)化通常是小概率事件，從大量的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(原生質(zhì)體) 背景中篩選出正向轉(zhuǎn)化子必須依賴于適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記，遺傳標(biāo)記可以是原養(yǎng)型生長、藥物或抗生素抗性、報(bào)告基因產(chǎn)生顏色等視覺特征等。

最初篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化子多是利用營養(yǎng)缺陷型菌株，通過將目標(biāo)基因與營養(yǎng)缺陷的野生型等位基因連鎖轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株中，在基本培養(yǎng)基中篩選原養(yǎng)型生長菌落而得到轉(zhuǎn)化子。目前，主要用于黑曲霉轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因有 pyr (嘧啶)、trp (色氨酸)、niaD (硝酸還原酶) 等。但是生產(chǎn)菌株往往不具有營養(yǎng)缺陷標(biāo)記，所以一般不能用這種方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。

在黑曲霉中廣為使用的抗性基因包括潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (hph) 基因 (對潮霉素具有抗性)[29-31]、鄰氨基苯甲酸合成酶基因的顯性突變基因 (trp3iar) (對5-氟吲哚具有抗性)[32]。

報(bào)告基因編碼一類特殊的蛋白質(zhì)或者酶，其特點(diǎn)是易于定性甚至定量檢測。用于黑曲霉轉(zhuǎn)化的報(bào)告基因主要有 E.coli β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)[33]、E. coli β-葡糖苷酶基因 (gus)[12]。這些報(bào)告基因編碼的酶可以催化指示化合物發(fā)生顯色反應(yīng)，不僅能夠直觀地指示正向轉(zhuǎn)化子，而且可以據(jù)此對基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，用于測量啟動子啟動效率或者測量轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。

3.4 轉(zhuǎn)化方法

外源 DNA 導(dǎo)入黑曲霉中最普遍使用的方案是CaCl2/PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。首先是用溶壁酶處理菌絲體或萌發(fā)的孢子獲得原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體、外源載體DNA混合于一定濃度的CaCl2、PEG (聚乙二醇) 緩沖液中進(jìn)行融合轉(zhuǎn)化。然后將原生質(zhì)體涂布于再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。1994年日本的 Ozeki等在黑曲霉中建立了孢子電轉(zhuǎn)化法[34]。電轉(zhuǎn)化孢子的方法較原生質(zhì)體法簡單、高效，在多種絲狀真菌已有應(yīng)用實(shí)例，是粗糙鏈孢霉遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法之一。孢子電轉(zhuǎn)化的過程主要包括：收集培養(yǎng)至少8 d的孢子；將孢子用冷凍山梨醇反復(fù)沖洗3次并懸?。槐蠈NA與細(xì)胞輕柔混勻并電轉(zhuǎn)化；之后加入山梨醇混勻涂平板。

4 討論與展望

黑曲霉可以作為通用細(xì)胞工廠的一個前提是其生物安全性。FDA已經(jīng)認(rèn)定黑曲霉的安全性屬于GRAS (Generally regarded as safe，通常認(rèn)為是安全的)?；蚪M數(shù)據(jù)和對黑曲霉遺傳代謝、蛋白質(zhì)分泌分子機(jī)制的理解進(jìn)一步推動了將黑曲霉開發(fā)為細(xì)胞工廠的研究活動。黑曲霉蛋白質(zhì)分泌途徑的認(rèn)識和改造研究非?；钴S，包括荷蘭帝斯曼及合作者、丹麥技術(shù)大學(xué)和德國不倫瑞克工業(yè)大學(xué)等多個有競爭力的團(tuán)隊(duì)，有希望在不久的將來，全面解析其高效蛋白質(zhì)分泌的分子機(jī)理，將黑曲霉開發(fā)成為一個通用的工業(yè)酶和異源蛋白質(zhì)表達(dá)的載體。在代謝工程改造方面，Jens Nielsen的團(tuán)隊(duì)在改造黑曲霉生產(chǎn)琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸方面作了一些工作[35-36]。

另外黑曲霉也可以被開發(fā)為次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。近年來不斷發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物。經(jīng)過鑒定的不同次級代謝物就有140多種，其諸多次級代謝物在食品、飼料及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中都有很好的應(yīng)用并且被認(rèn)為是安全的?；蚪M數(shù)據(jù)也揭示了黑曲霉產(chǎn)生眾多次級代謝產(chǎn)物的分子基礎(chǔ)[3]，包括數(shù)個次級代謝產(chǎn)物基因簇。黑曲霉基因組上有17個非核糖體肽合成酶 (NRPS) 和34個聚酮合成酶 (PKS)。但是近期關(guān)于曲霉次級代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素A及煙曲霉毒素B2的毒性問題也提醒我們不能因?yàn)楹谇咕哂蠫RAS認(rèn)證就忽視了對其安全性的關(guān)注。

構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工程的工作還剛剛起步，距離應(yīng)用還有相當(dāng)大的距離。隨著黑曲霉遺傳操作工具的不斷成熟，可以預(yù)見將有更多的團(tuán)隊(duì)加入到黑曲霉的改造活動中，黑曲霉作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)工業(yè)酶、異源蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、次級代謝產(chǎn)物等將呈現(xiàn)日益美好的前景。

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