王正茂，李琳，管文燕，李越希,2

1 南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，南京 210029

2 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002

單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus，HSV) 是一種雙鏈DNA病毒，屬皰疹病毒科α亞科，根據(jù)抗原性差別可分為I型和II型。I型主要引起口面部感染、眼部感染和皰疹性腦炎等；II型主要引起生殖器感染，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[1]。HSV可在感染組織或附近部位繁殖形成原發(fā)灶，并在感覺神經(jīng)節(jié)建立終身潛伏期，同時(shí)消除宿主的免疫應(yīng)答，當(dāng)受到外界刺激時(shí)又可重新繁殖并通過軸突運(yùn)輸返回原發(fā)感染灶附近形成復(fù)發(fā)感染[2]。這些因素導(dǎo)致人體一旦感染HSV，很難被有效清除。美國每年新發(fā)病人數(shù)達(dá)70萬，復(fù)發(fā)的病人約有1 000萬。在發(fā)展中國家，HSV II血清流行率高達(dá)41%~83%。近年來我國的HSV感染發(fā)病率迅速上升，其中HSV I的感染顯著增多，約占該病的 10%~40%。盡管目前的抗病毒藥物治療能縮短原發(fā)感染的病程，但并不能有效預(yù)防原發(fā)感染、已經(jīng)建立的潛伏感染及復(fù)發(fā)性疾病[3-4]。因此，研制和接種安全有效的 HSV疫苗是預(yù)防該病毒感染的理想方法[5]。目前較為普遍并且已經(jīng)進(jìn)入III期臨床的亞單位疫苗是由Glaxo Smith Kline公司生產(chǎn)的gD2-硫酸鋁鉀-3dMPL疫苗，所用佐劑3-dMPL能夠增強(qiáng)Th1應(yīng)答，雖然可以明顯減輕首次感染 HSV II的癥狀，但該結(jié)果僅限于HSV I和HSV II血清學(xué)反應(yīng)陰性的女性中。Chiron公司研制的一種重組gD2/gB2糖蛋白與MF59佐劑配伍而成的疫苗增強(qiáng)了Th2應(yīng)答，人類中可引起強(qiáng)烈的中和抗體，但是III期臨床試驗(yàn)效果有限。

HSV包膜糖蛋白在病毒的感染過程中起重要作用，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合及融合，其中g(shù)D糖蛋白能誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生及細(xì)胞免疫[6]，具有重要的抗原表位，是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)之一，是構(gòu)建HSV疫苗的理想抗原。本研究將HSV1 gD 蛋白的胞外區(qū)片段在真核表達(dá)系的HEK293細(xì)胞中表達(dá)、純化，對純化的蛋白進(jìn)行抗原性鑒定，免疫小鼠檢測血清中抗gD1抗體效價(jià)以評價(jià)其免疫原性，為HSV基因重組亞單位疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coli DH5α、HEK293細(xì)胞及真核表達(dá)載體 pCEP4由本實(shí)驗(yàn)室保存。

PrimerSTAR HS DNA Polymerase、dNTPs、Hind III、BamH I、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。Ni Sepharose 6 Fast Flow凝膠為GE Heathcare公司產(chǎn)品。羊抗HSV1+HSV2多抗為Abcam公司產(chǎn)品。小鼠抗His單抗、羊抗小鼠IgG-HRP為金斯特公司產(chǎn)品。雄性昆明小鼠，6~8周齡，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位篩選及基因片段合成

利用 ANTHEWIN等軟件，通過計(jì)算機(jī)分析GenBank中HSV病毒I型KOS株包膜糖蛋白D的胞外區(qū)氨基酸序列，篩選抗原表位富集區(qū)，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，并且在 5′端添加人IgG輕鏈可變區(qū)信號(hào)肽序列、8×His標(biāo)簽及TEV酶切位點(diǎn)，用化學(xué)合成的方法合成全新的基因序列g(shù)D1。

1.2.2 pCEP4-gD1重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆和鑒定

用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取含重組基因片段gD1的質(zhì)粒和pCEP4質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒經(jīng)Hind III和BamH I酶切后，電泳回收gD1基因片段和pCEP4質(zhì)粒片段，T4 DNA連接酶于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5α，以氨芐青霉素為篩選標(biāo)記，菌落PCR鑒定篩選含重組質(zhì)粒的克隆，提取重組質(zhì)粒pCEP4-gD1進(jìn)行PCR鑒定，酶切鑒定及DNA序列測定。

1.2.3 重組質(zhì)粒的真核瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定

轉(zhuǎn)染前1天以2×105/孔的密度接種HEK293細(xì)胞至24孔板，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)過夜，使其達(dá)到孔底面積 90%~95%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對 HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，詳細(xì)方法見Lipofectamine 2000操作手冊。37℃、5% CO2、DMEM培養(yǎng)基溫箱培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，NC膜濕轉(zhuǎn)，100 V，1 h，室溫封閉1 h (5% milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10 min，小鼠抗His單抗 (1 mg/mL) 1∶5 000稀釋于封閉液中，室溫孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，羊抗小鼠IgG-HRP 1∶5 000稀釋于封閉液中，室溫孵育1 h，洗膜3次，每次10 min，加發(fā)光底物反應(yīng)3 min，暗室中壓片曝光。

1.2.4 重組糖蛋白的純化、鑒定及濃度檢測

上清溶液加已經(jīng)平衡的Ni Sepharose 6 Fast Flow凝膠3 mL，混勻后4℃結(jié)合過夜，上樣，收集穿透液。用10倍柱床體積的平衡液 (1× PBS，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH 7.4) 洗滌柱子，洗脫親和層析柱上未結(jié)合的雜蛋白，接著將1 mL洗脫液 (1× PBS，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L imidazole，pH 7.4)加入膠體中，靜置20 min后洗脫，收集洗脫液，用透析液 (1× PBS，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4) 透析過夜，即為純化的目的蛋白，Western blotting檢測，方法同前。BCA法檢測純化后總蛋白的濃度。

1.2.5 重組糖蛋白抗原性檢測

用1× PBS (pH 7.4) 按1∶25~1∶800倍比稀釋純化的重組gD1糖蛋白，包被酶聯(lián)板 (陰性對照取正常HEK293細(xì)胞上清)，每孔100 μL，4℃過夜。次日用封閉液 (1× PBS，1%小牛血清) 封閉，每孔130 μL，室溫2 h。將山羊抗HSV1+HSV2多抗，用樣本稀釋液 (1× PBS，0.1%小牛血清) 1∶500稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100 μL，37℃孵育1 h，用PBST (1× PBS，0.5%吐溫?20) 洗5遍后，加1∶40 000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP，每孔100 μL，37℃反應(yīng)30 min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液，每孔100 μL，37℃避光顯色10 min，每孔加50 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。

1.2.6 免疫小鼠及gD1抗血清的制備

將小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。將純化的重組gD1糖蛋白與福氏佐劑等體積混合后分別于第1、3、5周 (第1周用完全福氏佐劑，第3、5周用不完全福氏佐劑) 腹腔注射免疫小鼠，高劑量組1.25 μg/只/次，低劑量組 0.5 μg/只/次，陰性對照組注射等體積PBS，并于第 3、5、7周眼眶采血。血液 37℃放置1 h后4℃過夜，2 000 r/min離心20 min，取上清，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清即得重組蛋白gD1抗血清。

1.2.7 重組蛋白gD1的免疫原性檢測

用1× PBS按1∶100稀釋純化的重組gD1糖蛋白，包被酶聯(lián)板，每孔100 μL，4℃過夜。次日用封閉液封閉酶聯(lián)板，每孔130 μL，室溫2 h。將制備的抗血清用樣本稀釋液按 1∶50、1∶500、1∶5 000稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100 μL，37℃反應(yīng)1 h，用PBST洗5遍后，加1∶10 000稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP，每孔 100 μL，37℃反應(yīng)30 min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100 μL，37℃避光顯色10 min，加50 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。

2 結(jié)果

2.1 目的基因片段的獲得

通過ANTHEWIN等軟件分析gD1糖蛋白胞外區(qū)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)N端的第1~284個(gè)氨基酸為抗原表位富集區(qū)，且親水性較好，采用OptimumGene軟件對對應(yīng)的編碼DNA序列進(jìn)行以下方面優(yōu)化：消除稀有密碼子而采用最佳密碼子、調(diào)整編碼序列GC含量、最小化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響、消除CpG島、避免重復(fù)序列和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)等影響，化學(xué)合成了全新的基因序列 gD1。同時(shí)分別在合成基因的兩端添加了Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)，在5′端酶切位點(diǎn)之后插入轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，起始密碼子，人IgG 輕鏈可變區(qū)信號(hào)肽，8×His標(biāo)簽及TEV 蛋白酶酶切位點(diǎn)，在3′端酶切位點(diǎn)之前插入終止密碼子，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒pCEP4的Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)之間，并且使重組蛋白更易于表達(dá)和純化 (圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒 pCEP4-gD1的構(gòu)建、克隆及序列測定

將重組基因經(jīng)酶切后克隆到真核表達(dá)載體pCEP4中 (圖2)，菌落PCR鑒定篩選含重組質(zhì)粒的克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)一步PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明擴(kuò)增的片段與預(yù)期大小一致，為981 bp (圖3)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明酶切片段大小與預(yù)期相符 (圖 4)。DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)，重組質(zhì)粒中含有合成的gD1基因片段，序列完全正確。

2.3 重組糖蛋白gD1的真核表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒pCEP4-gD1轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞48 h后，SDS-PAGE蛋白電泳檢測蛋白濃度很低幾乎看不見條帶 (圖5A)。Western blotting檢測顯示表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在于細(xì)胞上清中，分子量約46 kDa，與預(yù)期大小相符，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無此條帶 (圖6A)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒N端帶有8個(gè)組氨酸標(biāo)簽，所以利用 Ni-NTA進(jìn)行親和層析純化，吸附于Ni-NTA親和柱的gD1在咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)被洗脫，對透析液充分透析后，SDS-PAGE蛋白電泳 (圖5B) 和Western blotting檢測顯示純化后重組蛋白濃度明顯大于純化前 (圖 6B)。BCA法檢測總蛋白濃度約95 μg/mL。

圖1 gD1重組基因片段構(gòu)建示意圖Fig. 1 Structure sketch of gD1 recombinant gene.

圖2 重組質(zhì)粒pCEP4-gD1構(gòu)建流程Fig. 2 Construction of the recombinant plasmid pCEP4-gD1.

圖3 重組基因片段gD1 PCR檢測Fig. 3 Detection of the recombinant gene fragment gD1 by PCR amplification. 1: DL2000 marker; 2: gD1 DNA fragment amplified by PCR.

圖4 重組質(zhì)粒pCEP4-gD1的酶切鑒定Fig. 4 Identification of the recombinant plasmid pCEP4-gD1 by digestion with Hind III and BamH I. 1: pCEP4-gD1 digested with Hind III and BamH I; 2: pCEP4 digested with Hind III and BamH I; 3: 250 bp marker.

2.4 重組蛋白gD1的抗原性分析

為檢驗(yàn)純化得到的重組蛋白是否具有生物學(xué)活性，用 ELISA法檢測了該重組蛋白與羊抗HSV1+HSV2多抗在體外的結(jié)合能力。結(jié)果表明gD1重組蛋白與羊抗HSV1+HSV2有較好抗原抗體反應(yīng)(圖7)。說明經(jīng)真核修飾表達(dá)的gD1在純化后保持其與特異性抗體結(jié)合的能力，具有良好的生物學(xué)活性。

2.5 重組蛋白gD1的免疫原性分析

圖5 SDS-PAGE檢測重組gD1蛋白Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purified gD1 protein. (A) Detection of non-purified fraction of gD1 by SDS-PAGE. M: protein marker; 1: supernatant of HEK293/pCEP4, negative control; 2: supernatant of HEK293/pCEP4-gD1. (B) Detection of purified fraction of gD1 by SDS-PAGE. M: protein marker; 1: purified fraction of gD1.

圖6 Western blotting檢測純化前 (A) 和純化后 (B) 的重組gD1蛋白Fig. 6 Western blotting analysis of the purified gD1 protein. (A) Detection of non-purified fraction of gD1 by Western blotting. M: protein marker; 1: supernatant of HEK293/pCEP4-gD1; 2: supernatant of HEK293/pCEP4, negative control; 3: 25 ng Multiple-tag, positive control. (B) Detection of purified fraction of gD1 by Western blotting. 1: purified fraction of gD1; 2: supernatant of HEK293/pCEP4, negative control; 3: 25 ng Multiple-tag, positive control; 4: protein marker.

圖7 ELISA檢測重組蛋白gD1抗原性Fig. 7 Detection of the antigenicity of the recombinant protein gD1 by ELISA.

圖8 ELISA檢測小鼠血清抗重組蛋白gD1抗體效價(jià)Fig. 8 Determination of the polyclonal antibody titer of the mouse serum by indirect ELISA. 1: serum of pre-immunization; 2: serum of 2nd-immunization; 3: serum of 3rd-immunization.

每次免疫后間隔1周小鼠眼底靜脈叢取血，常規(guī)方法制備抗血清后，ELISA法檢測血清中抗體滴度。結(jié)果顯示低劑量免疫組免疫效果較差，3次免疫的血清中抗體水平無明顯差異，1∶50稀釋后A450最高值為0.168 (未在圖中顯示)；高劑量組免疫效果較好，第2次免疫后血清中抗體水平最高，1∶5 000稀釋后A450=1.104±0.384，第3次免疫后血清抗體水平稍有下降 (圖8)，PBS陰性對照組血清中基本無特性抗體產(chǎn)生，1∶50稀釋后A450=0.004±0.001。高劑量組抗血清中抗體濃度與 OD值良好的線性關(guān)系說明制備的重組蛋白gD1能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較好的體液免疫效果，具有較好的免疫原性。

3 討論

外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)按照表達(dá)載體的不同可分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)量高，且所需成本相對比較低廉，雖然原核表達(dá)技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但還存在一些難以克服的缺點(diǎn)，如目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；翻譯后的加工修飾系統(tǒng)不完善使得表達(dá)的蛋白與天然蛋白的構(gòu)象差距較大，生物學(xué)活性較低[7]。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)則在翻譯后修飾方面有較大優(yōu)勢。目前基因工程中常用的的真核表達(dá)系統(tǒng)有：酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。在這些表達(dá)系統(tǒng)中，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)在蛋白的起始信號(hào)、加工、分泌、糖基化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，適合完整的大分子蛋白的表達(dá)。而外源基因在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)又可分為：病毒介導(dǎo)的表達(dá)；外源基因在哺乳動(dòng)物中的瞬時(shí)表達(dá)；外源基因在哺乳動(dòng)物中的穩(wěn)定表達(dá)；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；核酸免疫等。通常在選擇穩(wěn)定序列表達(dá)之前先進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究，以鑒定整個(gè)系統(tǒng)是否適合外源蛋白的表達(dá)，因此本研究采用在 HEK293細(xì)胞中做gD1蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，以檢測表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。該細(xì)胞株是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)受體細(xì)胞之一。它適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)，已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑、干擾素γ、干擾素β、凝血因子Ⅷ等在HEK293細(xì)胞中得到表達(dá)[8]。

HSV包膜糖蛋白中g(shù)D免疫原性及誘導(dǎo)保護(hù)性作用最強(qiáng)，能誘發(fā)特異性應(yīng)答，HSV I上的免疫顯性表位廣泛分布在此蛋白質(zhì)上，具有重要的抗原表位，是宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)之一[9]，并參與病毒穿膜過程，介導(dǎo)了病毒的細(xì)胞間擴(kuò)散，在病毒感染和宿主免疫過程中起著重要作用，因此gD糖蛋白是目前HSV疫苗研究的熱點(diǎn)[10-11]。

有研究報(bào)道去除 gD蛋白分子部分胞漿區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域有助于蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，更有利于MHC分子的遞呈，產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答，在體內(nèi)外均能阻斷HSV對細(xì)胞的感染，抑制病毒在細(xì)胞間的傳播[12-13]。本實(shí)驗(yàn)選取去除了胞漿區(qū)及跨膜結(jié)構(gòu)域的gD1基因胞外區(qū)序列，并將5′端天然信號(hào)肽序列替換為人IgG輕鏈可變區(qū)信號(hào)肽序列，這樣的核酸序列修飾增強(qiáng)了gD1基因的體內(nèi)免疫原性、穩(wěn)定性和其他藥理特性。在克隆至真核表達(dá)載體pCEP4并轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blotting分析，所獲得的重組gD1蛋白主要分子量條帶約為46 kDa，糖基化均一，無其他雜帶，經(jīng)鎳柱親和層析后，取得較好的純化效果，ELISA檢測顯示其能與HSV1+HSV2多抗特異性結(jié)合，具有較好的抗原性。純化后的重組gD1蛋白免疫昆明小鼠后可誘發(fā)針對gD1的特異性體液免疫應(yīng)答，具有確切的免疫原性。而高劑量組與低劑量組血清中抗體水平的差異指出了抗原濃度對于免疫效果的影響，為下一步抗原免疫濃度的制定提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果為HSV亞單位疫苗和HSV診斷抗原的進(jìn)一步研究開發(fā)打下基礎(chǔ)。

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