區(qū)偉佳，王榮，李華興，陳愉敏

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州510642）

大豆根腐?。⊿oybean root rot）在國內(nèi)外大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是土傳病害，危害較重。該病對產(chǎn)量影響大，感病品種產(chǎn)量損失一般為5%～10%,嚴(yán)重的可達(dá)90%以上，甚至絕產(chǎn)。每年給國家造成巨額經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。生物防治手段越來越普遍應(yīng)用于植物病害防治，由于生防細(xì)菌具有對人畜無害、環(huán)境友好等特點(diǎn)，受到世界各國的普遍重視；而且土壤施用含有生防菌株的生物肥料能減少農(nóng)藥的用量，降低成本，同時還能改善土壤條件及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[3]。

農(nóng)用微生物制劑仍存在活菌數(shù)含量相對偏低、后處理和加工工藝落后等問題[4]，更主要的是科研人員對下游技術(shù)重視不足。微膠囊化技術(shù)能把生防菌包裹在囊壁物質(zhì)中，制成幾微米至幾百微米的微球體，具有調(diào)節(jié)有效成分釋放、降低施藥量、防治漂移、節(jié)省人工、擴(kuò)大防治幅度、使原來不能混用的藥劑可以混用和掩蓋忌避作用[5]。通過調(diào)節(jié)芯材濃度更能使農(nóng)用微生物產(chǎn)品的有效活菌數(shù)達(dá)到一般采用的深層發(fā)酵無法達(dá)到的程度。

運(yùn)用噴霧干燥生產(chǎn)微膠囊制劑是下游技術(shù)領(lǐng)域的重要組成部分，而相關(guān)大豆根腐病生防菌制劑的技術(shù)研究國內(nèi)尚未見公開報道。本研究系統(tǒng)研究了噴霧干燥工藝參數(shù)對大豆生防菌AF67粉劑性能的影響，建立描述產(chǎn)品指標(biāo)與工藝參數(shù)關(guān)系的多元指數(shù)模型，優(yōu)化噴霧干燥條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）AF67，分離自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆試驗(yàn)田的大豆植株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤系生物肥料研究室分離、鑒定并保存。

1.2 試劑與設(shè)備

麥芽糊精、阿拉伯膠：上海伯奧生物科技有限公司；氯化鈣、吐溫80：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SY-6000小型高速噴霧干燥器：上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 填充劑與AF67的生物相容性試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)，制備麥芽糊精濃度為10%、15%、20%、25%的LB平板；阿拉伯膠濃度為1%、1.5%、2%、2.5%的LB平板。AF67發(fā)酵液稀釋至10-5、10-6、10-7，3個稀釋度到該固體平板。37℃培養(yǎng)48h，計算菌落數(shù)。以不含填充劑的LB培養(yǎng)基作對照。

1.4 發(fā)酵液的制備

菌種先于LB平板劃線培養(yǎng)48h，挑出單菌落，接入LB培養(yǎng)液于37℃，150rpm，培養(yǎng)24h，最后按3%（1×108cfu/mL）的接種量接種到該菌優(yōu)化培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)基配方為：牛肉浸膏1%，蛋白胨 3.5%，可溶性淀粉 1.8%，葡萄糖 1%，150rpm，37℃恒溫培養(yǎng)48h。

1.5 微膠囊化工藝方案

實(shí)驗(yàn)以進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)料速度、芯材與填充劑配比、固型物含量為因素(見表1)，按L16(45)設(shè)計，結(jié)果以微膠囊收率、生防菌存活率、菌粉水分含量作為微膠囊產(chǎn)品的檢測性能指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析確定其最佳方案。

表1 因素水平編碼表

1.6 多元指數(shù)模型的建立

判定噴霧干燥各因素對產(chǎn)品收率、存活率、水分含量的影響規(guī)律對其進(jìn)行數(shù)學(xué)描述。按照化工數(shù)據(jù)處理中常用的因次分析法，通過 SAS(Statistical Analysis System)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，建立以多元指數(shù)形式所表示的數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 填充劑與AF67的生物相容性

附圖為含填充劑濃度l0%、15%、20%、25%的麥芽糊精和含1%、1.5%、2%、2.5%阿拉伯膠的LB培養(yǎng)基，以及不含填充劑的LB培養(yǎng)基，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)48h后活菌數(shù)情況。

a圖中1為CK；2、3、4、5分別為10%、15%、20%、25%的麥芽糊精

附圖 填充劑與AF67的生物相容性

如附圖所示，在不含填充劑的LB培養(yǎng)基中，生防菌AF67經(jīng)48h培養(yǎng)后活菌數(shù)為4.1×108cfu/mL。麥芽糊精和在培養(yǎng)基中的比例為10%、15%、20%、25%時，活菌數(shù)分別為 5.88×108cfu/mL、6.56×108cfu/mL、7.14×108cfu/mL、6.11×108cfu/mL。當(dāng)阿拉伯膠在培養(yǎng)基中比例分別為1%、1.5%、2%、2.5%時 ， 活 菌 數(shù) 分 別 為 6.76×108cfu/mL、6.40×108cfu/mL、5.77×108cfu/mL、5.52×108cfu/mL。結(jié)果顯示，含有填充劑的LB培養(yǎng)基均比不含填充劑的活菌數(shù)高。而且，填充劑的存在以及在培養(yǎng)基中的比例對生防菌AF67的生長不但沒有起到阻礙或者抑制作用，反而促進(jìn)了生防菌生長。由此可見，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的填充劑有著良好的生物相容性。

2.2 微膠囊化工藝優(yōu)化

制備好的發(fā)酵液經(jīng)4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，按正交試驗(yàn)方案要求配制濃度比例。其中阿拉伯膠與麥芽糊精比例按1：9作填充劑，并在噴霧母液中加入1%CaCl2作抗熱保護(hù)劑和0.2%的吐溫80作表面活性劑，混勻后入塔干燥。微膠囊化工藝各參數(shù)對生防菌AF67菌粉的影響見表2。

表2 噴霧干燥正交試驗(yàn)結(jié)果 %

2.2.1 噴霧干燥參數(shù)對菌粉收率的影響 正交試驗(yàn)方差分析采用Duncan新復(fù)極差法，結(jié)果顯示，噴霧干燥工藝參數(shù)對菌粉收率影響順序?yàn)椋哼M(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度>固型物含量>芯材與填充劑配比。其中進(jìn)料速度和進(jìn)風(fēng)溫度對收率影響顯著(p<0.05)，而芯材與填充劑配比偏差平方和很小，可認(rèn)為對菌粉收率沒有影響(見表3)。

表3 AF67菌粉收率方差分析

進(jìn)料速度增加或進(jìn)風(fēng)溫度降低，導(dǎo)致出風(fēng)口溫度降低，使菌粉含水量增加。容易引起濕粉粘壁產(chǎn)量下降，因此進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料速度對收率的影響較大。

2.2.2 噴霧干燥參數(shù)對菌粉存活率的影響 噴霧干燥工藝參數(shù)對存活率影響順序?yàn)?進(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度>芯材與填充劑配比>固型物含量。其中進(jìn)料速度對存活率影響極顯著(p<0.01)，進(jìn)風(fēng)溫度和芯材與填充劑配比對存活率影響顯著（p<0.05），固型物含量對存活率影響不顯著（見表4）。

表4 AF67菌粉存活率方差分析

熱敏性微生物在干燥中死亡為一級降解反應(yīng)，進(jìn)風(fēng)溫度升高不僅使恒速干燥階段的濕球溫度升高，而且在進(jìn)料速度一定時出風(fēng)溫度也隨之升高，導(dǎo)致生防菌死亡速度加快[6]。提高進(jìn)料速度使出風(fēng)口溫度降低，有利于降低菌體高溫死亡率。在本試驗(yàn)中，出風(fēng)口溫度因進(jìn)料速度的改變發(fā)生變化幅度較大，故對生防菌存活率影響極顯著。填充劑比例的增大有利于提高存活率，這是由于噴霧時微粒直徑較大內(nèi)部菌體可以得到外科的保護(hù)而不容易失活。

2.2.3 噴霧干燥參數(shù)對菌粉含水量的影響 噴霧干燥工藝參數(shù)對含水量影響順序?yàn)?進(jìn)料速度>進(jìn)風(fēng)溫度>固型物含量>芯材與填充劑配比。其中進(jìn)料速度和進(jìn)風(fēng)溫度對菌粉含水量影響顯著(p<0.05)，固型物含量對含水量有影響（p<0.1），芯材與填充劑配比對含水量影響不顯著（見表5）。

表5 AF67菌粉含水量方差分析

進(jìn)料速度對含水量的影響主要體現(xiàn)在對出風(fēng)口溫度的調(diào)節(jié)上，當(dāng)進(jìn)風(fēng)口溫度一定時，進(jìn)料速度降低有利于提高出風(fēng)口溫度，使霧滴與空氣之間的對數(shù)平均溫度差增加，導(dǎo)致干燥速率加快，產(chǎn)品含水量降低[7]。進(jìn)風(fēng)口溫度升高可以提高蒸發(fā)強(qiáng)度，使霧滴表面固化的時間提前，故對干粉的含水量有顯著影響。

2.3 多元指數(shù)模型

噴霧干燥各因素對產(chǎn)品收率、存活率、水分含量的影響規(guī)律按照化工數(shù)據(jù)處理中常用的因次分析法進(jìn)行數(shù)學(xué)描述，建立以多元指數(shù)形式所表示的數(shù)學(xué)模型[8]。

式中：Y為因變量；K為系數(shù)；A為進(jìn)風(fēng)溫度；B為進(jìn)料速度；C為芯材與填充劑配比；D為固型物含量；a，b，c，d為指數(shù)。

數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)處理，通過SAS進(jìn)行多元線性回歸，得到如下數(shù)學(xué)模型:

式中：Y1表示菌粉收率，Y2表示存活率，Y3表示含水量。

通過控制干燥工藝操作參數(shù)，可以在一定程度上達(dá)到預(yù)期的菌粉收率、存活率和含水量。

大豆生防菌AF67是熱敏型微生物，活菌產(chǎn)生的生防物質(zhì)是抗病的主要成分，為了得到生產(chǎn)成本低廉、活菌含量高的生物制劑，應(yīng)使菌粉收率與存活率的乘積最大。

要滿足Y1Y2=max，必須使A、D取最大值，B、C取最小值。即進(jìn)風(fēng)溫度為170℃，進(jìn)料速度為10mL/min，芯材與填充劑配比為1：8，固型物含量為25%。

2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上確定的最佳操作條件和模型預(yù)測趨勢，采用高溫和低速干燥進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明(見表6)，實(shí)測值與模型預(yù)測值比較接近，數(shù)學(xué)模型具有可靠性。但必須指出的是，上述模型是在本試驗(yàn)操作條件下，通過有限的工藝參數(shù)建立，不能隨意外推。隨著進(jìn)風(fēng)溫度升高和進(jìn)料速度降低，存活率將大幅降低，造成生產(chǎn)能力下降。因此，從提高生產(chǎn)能力和操作穩(wěn)定性的角度考慮，進(jìn)風(fēng)口溫度保持在170℃左右較為適宜。驗(yàn)證試驗(yàn)獲得的微膠囊產(chǎn)品經(jīng)檢測，有效活菌數(shù)達(dá)2.1×1010cfu/g比GB/T 20287-2006農(nóng)用微生物菌劑所要求濃度 2×108cfu/g高出超過100倍。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)確定了生防菌AF67噴霧干燥過程中影響菌粉收率、存活率、含水量的主要因素，分析變化規(guī)律，建立多元指數(shù)模型。該模型可以直觀的反映出工藝操作參數(shù)對上述指標(biāo)的影響趨勢。通過調(diào)整這些參數(shù)即可達(dá)到控制產(chǎn)品性能的目的。模型確定的最佳操作條件為：進(jìn)風(fēng)溫度170℃，進(jìn)料速度10mL/min，芯材與填充劑配比為1：8，固型物含量25%。微膠囊產(chǎn)品有效活菌數(shù)達(dá)2.1×1010cfu/g。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，進(jìn)一步降低進(jìn)風(fēng)溫度會降低蒸發(fā)能力，生產(chǎn)效率降低。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)證明，該數(shù)學(xué)模型具有可靠性。

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