張磊，桑敏，李愛(ài)芬，張成武

暨南大學(xué) 水生生物研究中心 熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣州 510632

能源是人類社會(huì)生存與發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著化石燃料的日益消耗殆盡，尋求并開(kāi)發(fā)清潔無(wú)污染的綠色替代能源已成為科技工作者關(guān)注的重要課題[1]。氫作為一種理想的可再生能源，具有燃燒熱值高、無(wú)污染和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為綠色能源開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方向[2-3]。

綠藻體內(nèi)具有可逆氫酶，能將光合作用中產(chǎn)生的部分質(zhì)子還原為氫氣[4]。早在 1942年，Gaffron和 Rubin就證實(shí)了綠藻斜生柵藻 Scenedesmus obliquus 可通過(guò)光合作用產(chǎn)氫[5]，此后陸續(xù)報(bào)道其他許多綠藻具有光合產(chǎn)氫特性[6-7]。研究已知，綠藻的可逆氫酶對(duì)氧氣十分敏感，1.5%的氧濃度即可使其迅速失活[8]。因此，人們對(duì)綠藻產(chǎn)氫研究更多關(guān)注其產(chǎn)氫機(jī)制以及如何提高產(chǎn)氫效率。目前研究較多的是萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii光合產(chǎn)氫，Dennis報(bào)道，萊茵衣藻在缺磷和缺硫條件下，光合放氧能力顯著下降[9]。2000年，Melis 教授提出了缺硫兩步法制氫技術(shù)，將綠藻光合放氧與產(chǎn)氫過(guò)程從時(shí)間上分開(kāi)，顯著提高了藻細(xì)胞的產(chǎn)氫效率[10]。研究證實(shí)，硫、氮和錳等營(yíng)養(yǎng)元素缺乏時(shí)，對(duì)微藻的光合作用具有較大影響[11-12]。氮素是組成氨基酸的必要成分之一，它的缺乏將直接限制光合膜蛋白以及包括葉綠素在內(nèi)的其他色素分子的合成，最終影響光合放氧能力[11]。錳通過(guò)參與光解水過(guò)程，將直接影響光合放氧[12]。蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa 是綠藻門(mén) Chlorophyta 小球藻屬Chlorella中的一種單細(xì)胞綠藻，本實(shí)驗(yàn)室已有研究證實(shí)了缺硫條件能促進(jìn)其光合產(chǎn)氫[13]，因此，本研究對(duì)比了氮、錳或硫缺乏的營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)蛋白核小球藻光合產(chǎn)氫及其生長(zhǎng)的影響，以期為微藻光合制氫技術(shù)的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

蛋白核小球藻 C. pyrenoidosa由暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種室提供。

1.2 藻細(xì)胞培養(yǎng)

使用TAP[14]培養(yǎng)液，將活化后的藻細(xì)胞接種至2 L的三角瓶，培養(yǎng)溫度為 (24±1)℃，光照強(qiáng)度約為100 μmol/(m2·s)，光暗時(shí)間比為12 h/12 h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

1.3 產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)與誘導(dǎo)條件

以 TAP培養(yǎng)液為產(chǎn)氫對(duì)照組，分別設(shè)置缺氮(TAP-N)、缺錳 (TAP-Mn) 和缺硫 (TAP-S) 三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。收集各實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期藻細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗滌 2次后定容至250 mL反應(yīng)器內(nèi) (藻液體積250 mL，上部空間24 mL)，充氬氣20 min后封閉反應(yīng)器，暗誘導(dǎo)32 h后放入光照強(qiáng)度約為80 μmol/(m2·s)的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔24 h測(cè)定產(chǎn)氫量。

1.4 氫氣含量測(cè)定

采用排水法讀取氣體體積，用氣相色譜檢測(cè)氣體組成，產(chǎn)氫過(guò)程中的氫氣含量由氣體組成百分比乘以氣體體積測(cè)得。氣相色譜儀型號(hào)為上?？苿?chuàng) GC 9800，色譜柱為 TDX-01，TCD熱導(dǎo)檢測(cè)器，汽化室溫度為70℃，柱溫為50℃，檢測(cè)器溫度為70℃。

1.5 光合與呼吸速率測(cè)定

光合與呼吸速率使用氧電極 (Hansatech Oxygraph，英國(guó)) 法測(cè)定。取2 mL藻液加入反應(yīng)杯，100 r/min持續(xù)攪拌，在溫度為25℃及440 μmol/(m2·s)的飽和光強(qiáng)下穩(wěn)定1 min左右后測(cè)量光合速率，每次記錄5 min，呼吸速率在黑暗條件下同等方法測(cè)得[15]。

1.6 葉綠素a含量測(cè)定

葉綠素a含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 氮、錳、硫缺乏對(duì)蛋白核小球藻產(chǎn)氫能力的影響

圖1是蛋白核小球藻在4種條件下的產(chǎn)氫結(jié)果。由圖 1可以看出，4種條件下蛋白核小球藻均能進(jìn)行光合產(chǎn)氫，不同條件下藻的產(chǎn)氫能力有明顯差異。對(duì)照組藻液的光合產(chǎn)氫持續(xù)時(shí)間最短，約 48 h，TAP-Mn和TAP-S產(chǎn)氫可持續(xù)72 h，TAP-N產(chǎn)氫持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)96 h。表1是蛋白核小球藻在4種條件下的產(chǎn)氫總量。在3種誘導(dǎo)產(chǎn)氫條件中，TAP-N組產(chǎn)氫量最高，為 88.613 μL H2/mg Chla，是對(duì)照組產(chǎn)氫量的4.61倍。TAP-Mn的產(chǎn)氫量為46.256 μL H2/mg Chla，TAP-S產(chǎn)氫量最低，為24.380 μL H2/mg Chla，是 TAP-N的 27.5%。以上結(jié)果顯示，缺氮可以較大程度地提高蛋白核小球藻的產(chǎn)氫效率。

圖1 不同條件下蛋白核小球藻產(chǎn)氫的比較Fig. 1 Comparison of hydrogen evolution by C. pyrenoidosa under different conditions. Control: TAP; TAP-N: nitrogen deprived TAP; TAP-Mn: manganese deprived TAP; TAP-S: sulfur deprived TAP.

表1 不同條件下蛋白核小球藻的產(chǎn)氫總量Table 1 Total hydrogen yield of C. pyrenoidosa under different conditions

2.2 氮、錳、硫缺乏對(duì)蛋白核小球藻光合與呼吸速率的影響

圖2所示的是蛋白核小球藻在光合產(chǎn)氫過(guò)程中光合與呼吸速率的變化趨勢(shì)。將蛋白核小球藻在不同條件下的光合放氧進(jìn)行比較可知，缺氮和缺硫條件對(duì)藻細(xì)胞光合放氧具有明顯的抑制作用，而前者較后者更為強(qiáng)烈。將蛋白核小球藻轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫誘導(dǎo)后，4種條件下前24 h內(nèi)藻細(xì)胞的光合放氧強(qiáng)度都保持穩(wěn)定。TAP組光合放氧速率從24 h后開(kāi)始迅速增加，48 h左右達(dá)到最大，最大值為74.619 μmol O2/(mg Chla·h)，之后慢慢回落，約120 h后回到初始值以下；TAP-Mn組藻細(xì)胞的光合放氧速率則在前48 h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，從48 h后開(kāi)始迅速增加，72 h后增至最大，最大值為73.652 μmol O2/(mg Chla·h)，之后緩慢回落；而 TAP-N和 TAP-S組藻細(xì)胞的光合放氧速率卻從24 h后開(kāi)始下降，分別于72 h和96 h降至最低，為16.927 μmol O2/(mg Chla·h)和12.551 μmol O2/(mg Chla·h) (表2)。

由圖 2亦可看出，在封閉 120 h內(nèi)，TAP、TAP-Mn和 TAP-S組的呼吸耗氧速率變化趨勢(shì)相似，先上升后下降，其中TAP和TAP-S組在48 h左右呼吸達(dá)到最大值，分別為35.319 μmol O2/(mg Chla·h)和17.797 μmol O2/(mg Chla·h)；TAP-Mn組呼吸最大值出現(xiàn)72 h左右，呼吸強(qiáng)度為27.892 μmol O2/(mg Chla·h)。而 TAP-N組的呼吸耗氧速率在產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直處于增強(qiáng)狀態(tài)，從初始值為2.200 μmol O2/(mg Chla·h) 增至120 h的40.183 μmol O2/(mg Chla·h) (表3)，且72 h后一直較大程度高于其他實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明缺氮條件在其脅迫后期對(duì)蛋白核小球藻的呼吸具有一定的促進(jìn)作用。

圖2 蛋白核小球藻光合產(chǎn)氫過(guò)程中光合與呼吸速率的變化Fig. 2 Changes of photosynthesis (P) and respiration (R) rate in C. pyrenoidosa grown in different mediums at the progress of photo-hydrogen evolution. Alga was grown in TAP medium (A) and nitrogen deprived TAP medium (B), manganese deprived TAP medium (C), sulfur deprived TAP medium (D). Measurements were taken with an oxygraph system (Hansatech Instruments) at 25°C, beginning with the record of dark respiration (5 min) and followed by the light-saturated rate of photosynthesis (another 5 min).

表2 蛋白核小球藻在不同條件下的光合速率Table 2 Photosynthesis rate of C. pyrenoidosa under different conditions

表3 蛋白核小球藻在不同條件下的呼吸速率Table 3 Respiration rate of C. pyrenoidosa under different conditions

綠藻產(chǎn)氫的關(guān)鍵因素之一在于厭氧環(huán)境的形成和維持，當(dāng)藻細(xì)胞的光合放氧速率低于其呼吸耗氧速率時(shí)，藻液體系隨即進(jìn)入理論上的厭氧狀態(tài)[10]。蛋白核小球藻在不同條件下的光合和呼吸速率變化結(jié)果表明，在其產(chǎn)氫過(guò)程中，TAP和TAP-Mn組藻細(xì)胞的光合放氧速率一直較大程度高于其呼吸耗氧速率 (圖2A、2C)，因而未能形成較好的厭氧環(huán)境；而TAP-N組光合放氧速率約48 h左右與呼吸耗氧速率持平，之后保持穩(wěn)定狀態(tài)，但卻一直低于日益增強(qiáng)的呼吸耗氧速率 (圖2B)，據(jù)此推測(cè)其形成厭氧環(huán)境的時(shí)間約為48 h左右；而TAP-S組形成厭氧環(huán)境的時(shí)間較TAP-N長(zhǎng)，藻細(xì)胞的光合放氧速率72 h后才與呼吸耗氧速率相接近 (圖2D)。

2.3 氮、錳、硫缺乏對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

蛋白核小球藻培養(yǎng)液在產(chǎn)氫過(guò)程中葉綠素 a含量變化如圖3所示。由圖3可以看出，蛋白核小球藻在 TAP培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)120 h產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)后，培養(yǎng)液中的葉綠素a含量為70.995 mg/L，比初始含量提高了4.03倍。氮、錳、硫缺乏對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)具有不同程度地抑制作用，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組藻液葉綠素a的含量明顯低于TAP組，其中缺氮和缺硫?qū)Φ鞍缀诵∏蛟宓纳L(zhǎng)影響最大，經(jīng)過(guò) 120 h產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，藻液的葉綠素 a含量分別從初始的20.796 mg/L和19.781 mg/L升到26.237 mg/L和22.449 mg/L。蛋白核小球藻在TAP-Mn培養(yǎng)液中有增長(zhǎng)，葉綠素a含量由實(shí)驗(yàn)初期的19.81 mg/L提高到53.099 mg/L，是初始含量的2.68倍。

圖3 蛋白核小球藻在光合產(chǎn)氫過(guò)程中葉綠素 a含量的變化Fig. 3 Changes of chlorophyll a content in C. pyrenoidosa at the progress of photo-hydrogen evolution.

3 討論

封閉、充氮?dú)夂桶嫡T導(dǎo)可為藻培養(yǎng)體系提供一個(gè)相對(duì)低氧甚至厭氧的環(huán)境[17]。在這種前提條件下，蛋白核小球藻在TAP以及TAP-N、TAP-Mn和TAP-S中均能進(jìn)行光照產(chǎn)氫。在最初的暗誘導(dǎo)階段，4種培養(yǎng)液中藻細(xì)胞的光合放氧能力均未發(fā)生顯著變化，文獻(xiàn)報(bào)道萊茵衣藻[9]在硫缺乏24 h后光合放氧能力下降75%，與萊茵衣藻相比，蛋白核小球藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏的脅迫條件耐受能力較強(qiáng)。恢復(fù)光照后，不同實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞的響應(yīng)有所差異，TAP組隨著光照條件的恢復(fù)，藻細(xì)胞的光合放氧速率迅速增大，48 h達(dá)到最大值，致使該體系中氧濃度迅速增加，氫酶受到抑制導(dǎo)致產(chǎn)氫過(guò)程停止，產(chǎn)氫過(guò)程從封閉開(kāi)始僅持續(xù)了約48 h。

錳元素是TAP培養(yǎng)液中的一種微量元素[14]，它作為光合膜上光系統(tǒng)Ⅱ放氧蛋白輔基，通過(guò)參與光解水反應(yīng)影響藻類的光合放氧[12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)錳的缺乏對(duì)蛋白核小球藻的光合放氧能力產(chǎn)生了一定影響，產(chǎn)氫期間TAP-Mn的光合放氧速率與TAP相比明顯降低。缺氮和缺硫條件均能明顯抑制蛋白核小球藻的光合放氧能力，其中，TAP-S組的光合放氧速率在封閉后72 h與其呼吸速率相近，而產(chǎn)氫僅持續(xù)72 h，推測(cè)可能是缺硫?qū)υ弩w的生理狀態(tài)影響較大，因而產(chǎn)氫過(guò)程未能持續(xù)更久。國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道，缺氮可限制藻細(xì)胞的光合作用和生長(zhǎng)[11,18]，本實(shí)驗(yàn)中 TAP-N組蛋白核小球藻的光合放氧速率下降迅速，在48 h左右就降到和其呼吸耗氧速度持平，這為蛋白核小球藻光合產(chǎn)氫創(chuàng)造了一個(gè)理論上的厭氧環(huán)境，促進(jìn)了光合產(chǎn)氫。呼吸作用的增強(qiáng)為光合產(chǎn)氫提供持續(xù)性的電子供給[19]，避免產(chǎn)氫后期由于 PSⅡ功能的衰弱而造成光合電子傳遞鏈的低效，這也是蛋白核小球藻在TAP-N中產(chǎn)氫比TAP-S效率高的原因之一。與TAP-N和TAP-S相比，在TAP-Mn中蛋白核小球藻的光合放氧受到的抑制較弱，究其原因，可能是藻細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)還有一定量的錳離子存在，這個(gè)推測(cè)還尚需進(jìn)一步缺錳傳代實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

葉綠素 a含量的動(dòng)態(tài)變化可以反映藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。在缺氮和缺硫的條件下，蛋白核小球藻的葉綠素 a含量隨著產(chǎn)氫過(guò)程的進(jìn)行保持相對(duì)穩(wěn)定，在TAP-Mn和TAP中藻液的葉綠素a含量有較大幅度提高，說(shuō)明缺錳條件對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)影響較小，而缺氮和缺硫明顯抑制了蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，這和 Hase等[20]報(bào)道的缺硫使萊茵衣藻停止生長(zhǎng)的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，缺氮條件能顯著抑制蛋白核小球藻的光合放氧及其生長(zhǎng)，促進(jìn)其呼吸作用，對(duì)藻細(xì)胞的光合產(chǎn)氫具有較大促進(jìn)作用。

綠藻產(chǎn)氫是一個(gè)微妙而復(fù)雜的過(guò)程，消除氧氣對(duì)氫酶活性的抑制作用是關(guān)鍵[17]。Melis教授利用了缺硫能抑制藻細(xì)胞光合作用的機(jī)理，將萊茵衣藻轉(zhuǎn)入缺硫培養(yǎng)基中，約24 h后藻細(xì)胞的光合作用強(qiáng)度開(kāi)始低于其呼吸作用，藻體系進(jìn)入?yún)捬鯛顟B(tài)，誘導(dǎo)氫酶光合產(chǎn)氫，其結(jié)果顯示該方法具有較高的產(chǎn)氫效率[10]。然而，本實(shí)驗(yàn)中的TAP-S組在封閉后的最初48 h內(nèi)，光合產(chǎn)氫效率低于TAP組。推測(cè)其原因可能是隨著產(chǎn)氫過(guò)程的進(jìn)行，TAP中藻細(xì)胞數(shù)量增多且生理狀態(tài)保持良好，光合電子傳遞比缺硫活躍[21]，而在缺硫條件下，藻的光合放氧能力雖有所下降，但藻細(xì)胞的生理狀態(tài)欠佳，細(xì)胞幾乎停止分裂生長(zhǎng)，造成產(chǎn)氫能力低下。上述結(jié)果提示，硫元素缺乏對(duì)不同藻種光合產(chǎn)氫的影響有差異。近年來(lái)亦有研究者探索綠藻新的產(chǎn)氫方法，如 Markov在2006年報(bào)道高光強(qiáng)脅迫亦可抑制萊茵衣藻光合放氧，而促進(jìn)產(chǎn)氫反應(yīng)，產(chǎn)量可達(dá)5.3 mL H2/(g dw·h)[22]。中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張衛(wèi)研究組利用解偶聯(lián)劑 CCCP調(diào)控扁藻 Platymonas subcordiformis產(chǎn)氫亦有較好結(jié)果，使扁藻的光合放氫量提高了近100倍[7]。因此探索新的產(chǎn)氫方法將是今后綠藻產(chǎn)氫的研究熱點(diǎn)之一。氮元素是培養(yǎng)基中的大量元素，本研究結(jié)果顯示對(duì)于蛋白核小球藻，缺氮法比缺硫法更具產(chǎn)氫效率，如果從誘導(dǎo)產(chǎn)氫的培養(yǎng)基成本考慮，缺氮法比經(jīng)典缺硫法更經(jīng)濟(jì)，值得注意。本研究小組下一步將利用高效產(chǎn)氫藻株，進(jìn)一步探討氮元素缺乏對(duì)微藻光合產(chǎn)氫的影響以及藻細(xì)胞光合產(chǎn)氫的作用機(jī)制。

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