林煒鐵，朱雅楠

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)分析硝化細(xì)菌微生物多樣性

林煒鐵，朱雅楠

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006

利用T_RFLP (末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性) 技術(shù)，分析硝化細(xì)菌富集反應(yīng)器中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)硝化細(xì)菌的豐度進(jìn)行半定量研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)48 h后，硝化細(xì)菌富集效果最佳，多樣性指數(shù)與初始培養(yǎng)相比下降了62.80%，富集出的硝化細(xì)菌主要為亞硝酸鹽氧化菌 (Nitrobacter)。同時(shí)對(duì)投加該硝化細(xì)菌前后的對(duì)蝦養(yǎng)殖水體進(jìn)行微生物多樣性的動(dòng)態(tài)研究，并推測(cè)了蝦塘水中可能穩(wěn)定存在的幾種主要細(xì)菌種類(lèi)，其中投加富集硝化細(xì)菌前后均存在的細(xì)菌種類(lèi)包括短芽孢桿菌Brevibacillus brevis、微桿菌Microbacterium lactium、固氮弧菌Azoarcus indigens或者霍氏鮑特菌Bordetella holmesii。

T_RFLP，硝化細(xì)菌，反應(yīng)器，群落結(jié)構(gòu)，微生物多樣性

T_RFLP技術(shù)是一種以分子系統(tǒng)學(xué)原理為基礎(chǔ)的研究微生物種群多樣性的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)[5]，在DNA水平上通過(guò)對(duì)特定核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性的測(cè)定來(lái)分析比較硝化細(xì)菌培養(yǎng)器內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)[6]，本研究利用 T_RFLP技術(shù)，對(duì)富集反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌進(jìn)行活性檢測(cè)，并對(duì)反應(yīng)器內(nèi)微生物群落的種群結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，從而更好地把握硝化細(xì)菌的增殖情況，解決收貨菌種的時(shí)間問(wèn)題，提高產(chǎn)業(yè)化效率。同時(shí)對(duì)投加該硝化細(xì)菌的對(duì)蝦養(yǎng)殖水體進(jìn)行微生物多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 采樣

本實(shí)驗(yàn)采用的硝化細(xì)菌在養(yǎng)殖蝦塘水中馴化2年后分離純化得到，亞硝酸鹽降解速率為580.7 mg/(g·d)，培養(yǎng)溫度為28℃~30℃。硝化細(xì)菌富集裝置為10 L氣升式反應(yīng)器，通氣量為100 L/h，培養(yǎng)基組成如下：NaNO20.5 g/L，KH2PO40.136 g/L，MgSO40.14 g/L，NaCl 0.3 g/L，NaHCO31.6 g/L，F(xiàn)eSO40.03 g/L，采用分批式補(bǔ)料方式，即每天補(bǔ)加NaNO2，每周更換1次培養(yǎng)基，在此條件下檢測(cè)出硝化細(xì)菌樣品生長(zhǎng)的遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期3個(gè)具有生長(zhǎng)代表性的時(shí)期，分別為培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。蝦塘選擇深度為1米，面積3畝的對(duì)蝦養(yǎng)殖塘，在此塘中投加5 L OD600為40的硝化細(xì)菌。取3個(gè)生長(zhǎng)代表期的硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)液及投加硝化細(xì)菌前和投加硝化細(xì)菌后的對(duì)蝦養(yǎng)殖水體水樣各1 L，置于4℃冰箱中保存待用。投加硝化細(xì)菌后的水塘取樣時(shí)間參照硝化細(xì)菌富集豐度最佳時(shí)間。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌總DNA提取

DNA的提取采用液氮研磨法：將水樣取出，抽濾后將細(xì)菌粉末連續(xù)加入液氮中，快速研磨。用DNA提取試劑盒提取研磨后菌體中的總 DNA，并于?20℃保存。

1.2.2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)：參考Fe′ray 等于1999年發(fā)表的硝化細(xì)菌 16S rDNA通用序列[7](FGPS1269，5′-TTT TTTGAGATTTGCTAG-3′；FGPS872，5′-CTAAAACT CAAAGGAATTGA-3′)。參考Leser等于2000年發(fā)表的細(xì)菌16S rDNA通用序列[8](8-27F，5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′；SD-BACT-0926，5′-CCGTC AATTCCTTTRAGTTT-3′)。引物的5′末端用6-FAM熒光標(biāo)記。引物由大連寶生物公司合成。

PCR反應(yīng)體系：利用1.2.1中的DNA提取物作為模板。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，內(nèi)含5 μL 10×PCR Buffer，4 μL dNTPs，上下游引物各0.2 μL，0.2 μL模板DNA，0.25 μL Taq酶 (TaKaRa公司)。

反應(yīng)條件：使用NOB引物，預(yù)變性95 ℃ 3 min ；變性94 ℃ 1 min ，退火50 ℃ 1 min ，延伸72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸5 min。使用細(xì)菌通用引物[9]：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火57℃45 s，延伸72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸4 min。反應(yīng)后，均置于?20℃保存。

1.2.3 PCR反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照。

1.2.4 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切

利用限制性?xún)?nèi)切酶Hae Ⅲ酶切PCR擴(kuò)增得到的16S rDNA產(chǎn)物，反應(yīng)總體系為20 μL，內(nèi)含10倍緩沖液2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，滅菌水6.5 μL，內(nèi)切酶Hae Ⅲ 1.5 μL。酶切產(chǎn)物的T_RFLP分析由上?；倒就瓿?。

1.2.5 T_RFLP圖譜分析

根據(jù) T_RFLP圖譜，對(duì)反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌的豐度進(jìn)行半定量檢測(cè)，并對(duì)其純度進(jìn)行分析。同時(shí)，通過(guò)登陸網(wǎng)站 http://mica.ibest.uidaho.edu/，選擇T_RFLP分析程序?qū)悠分谐霈F(xiàn)的限制性片段(Terminal Rest riction Fragment，T_RF) 進(jìn)行定性分析，每一個(gè)T_RF為一個(gè)操作分類(lèi)單元 (Operational taxonomy unit，OTU)，通過(guò)提交T_RFLP檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)文件以及規(guī)定限制性?xún)?nèi)切酶Hae Ⅲ，確定其中可能含有的微生物屬性，分析樣品中的微生物多樣性。

1.3 多樣性指數(shù)計(jì)算方法

根據(jù)Hae Ⅲ酶切得到的T_RFLP圖譜中T_RF (末端限制性片段數(shù)目) 及其相對(duì)峰高值，分別計(jì)算了樣品中不同培養(yǎng)時(shí)期的硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)。多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)的計(jì)算公式為：

均勻度指數(shù)：E1=H′/1nS

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌總DNA的提取

富集硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中提取的 DNA代表了富集培養(yǎng)液中所有微生物的總 DNA組成。提取的總DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在大于19 000 bp處有一條明顯擴(kuò)增條帶，如圖1所示。

2.2 16S rDNA PCR

以提取的總DNA為模板，利用NOB引物擴(kuò)增16S rDNA，在397 bp有明顯的特異性擴(kuò)增條帶，與引物序列擬擴(kuò)增的DNA序列大小一致，如圖2所示。

2.3 基于T_RFLP技術(shù)的微生物多樣性分析

2.3.1 基于T_RFLP技術(shù)的硝化細(xì)菌反應(yīng)器內(nèi)微生物多樣性分析

圖1 富集硝化細(xì)菌培養(yǎng)液細(xì)菌總DNAFig. 1 DNA in the enrichment reactor. (A) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 12 hours. (B) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 24 hours. (C) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 48 hours.

圖2 基于NOB 16S rDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 PCR amplifications based on 16S rDNA of NOB. (A) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 12 hours. (B) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 24 hours. (C) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 48 hours.

圖3 NOB通用引物對(duì)不同時(shí)間細(xì)菌DNA樣品進(jìn)行PCR，并用Hae Ⅲ 酶切后的T_RFLP圖譜Fig. 3 T_RFLP profiles based on bacteria16S rDNA with NOB primer at a different operating times. (A) Hae Ⅲ- digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 12 hours. (B) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 24 hours. (C) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 48 hours.

從硝化細(xì)菌反應(yīng)器內(nèi)提取的總 DNA的片段長(zhǎng)度為19 000 bp，利用NOB擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的16S rDNA片段大小為397 bp，符合預(yù)期的長(zhǎng)度。圖3是用自動(dòng)測(cè)序儀掃描16S rDNA的Hae Ⅲ酶切圖譜。圖譜上每個(gè)熒光峰至少代表 1種細(xì)菌或幾種近緣的細(xì)菌，每個(gè)峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)代表某種類(lèi)的微生物在該微生態(tài)群落中的相對(duì)數(shù)量。圖 3為培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后，富集培養(yǎng)箱中硝化細(xì)菌的T_RFLP檢測(cè)結(jié)果。其中片段36 bp代表Nitrobacter，即亞硝酸鹽氧化菌硝化桿菌屬，與Wen等[10]在流化反應(yīng)器中對(duì) NOB的菌種檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)存在硝化桿菌和硝化螺菌的結(jié)果稍有不同，可能是由于不同的反應(yīng)器系統(tǒng)造成的檢測(cè)結(jié)果不同。本實(shí)驗(yàn)利用NOB通用引物，對(duì)反應(yīng)器中的硝化細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，并且根據(jù) OTU數(shù)量，對(duì)硝化細(xì)菌樣品中的多樣性指數(shù)(Shannon Diversity，H′) 及均勻度指數(shù) (Shannon Diversity，E′) 進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

從不同時(shí)期硝化細(xì)菌反應(yīng)器內(nèi)的硝化細(xì)菌的OTU數(shù)量可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，OTU減少，由此推斷出反應(yīng)器內(nèi)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的微生物種類(lèi)減少；從硝化細(xì)菌的微生物多樣性指數(shù) (Shannon Diversity，H′) 看出，隨著時(shí)間的增加，硝化細(xì)菌的種類(lèi)趨于減少，尤其是當(dāng)取培養(yǎng)48 h的硝化細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，多樣性指數(shù)更是下降了62.80%，由此可見(jiàn)，反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌的培養(yǎng)純度逐漸增加。并且通過(guò)比較此時(shí)反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌的菌體數(shù)量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48 h的硝化細(xì)菌的豐度比例達(dá)到97%，明顯高于培養(yǎng)12 h以及培養(yǎng)24 h的硝化細(xì)菌豐度比例(表2)。

2.3.2 基于T_RFLP技術(shù)的蝦塘內(nèi)微生物多樣性分析

根據(jù)T_RFLP圖譜 (圖4) 中OTU數(shù)量，對(duì)投加硝化細(xì)菌前以及投加硝化細(xì)菌后的蝦塘水樣中的多樣性指數(shù) (Shannon Diversity H′) 進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 基于T_RFLP圖譜分析的微生物多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of microbial diversity based on T_RFLP profiles

表2 基于T_RFLP圖譜的硝化細(xì)菌半定量分析Table 2 Semi quantitative analysis of NOB based on T_RFLP profiles

表3 基于T_RFLP圖譜分析的微生物多樣性指數(shù)分析Table 3 Analysis of microbial diversity based on T_RFLP profiles

從投加菌前后的多樣性指數(shù)可以看出，蝦塘投加菌硝化細(xì)菌48 h后，塘內(nèi)細(xì)菌種類(lèi)明顯增加，從微生物多樣性指數(shù) (Shannon Diversity，H′) 來(lái)看，投加菌48 h后蝦塘內(nèi)微生物多樣性大于投加菌前，變化幅度為 9%。通過(guò)表 4可以看出，投加硝化細(xì)菌后，水塘內(nèi)該細(xì)菌數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖4 利用細(xì)菌通用引物分析投加硝化細(xì)菌前后蝦塘水中細(xì)菌16S rDNA的T_RFLP圖譜Fig. 4 T_RFLP profiles based on bacteria16S rDNA with bacterial universal primers before and after adding nitrifying bacteria. (A) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria in the shrimp ponds before adding nitrifying bacteria. (B) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria in the shrimp ponds after adding nitrifying bacteria.

表4 基于T_RFLP圖譜分析的蝦塘水中細(xì)菌半定量分析Table 4 Semi quantitative analysis of bacteria based on T_RFLP profiles in the pool

2.4 基于T_RFLP技術(shù)對(duì)蝦塘水中主要細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行快速定性分析

通過(guò)對(duì)投加硝化細(xì)菌前后都出現(xiàn)的 T_RF峰進(jìn)行分析，其中投加硝化細(xì)菌前后都出現(xiàn)的片段為9、17、18、23、36 bp (圖4)，經(jīng)檢測(cè)，片段36 bp代表投加的富集硝化細(xì)菌種群 (Nitrobacter)，與Terahara等[11]報(bào)道的廢水中的硝化細(xì)菌片段類(lèi)似。17 bp代表的微生物種類(lèi)可能性較復(fù)雜，不能確定具體的種屬，9 bp代表的微生物種類(lèi)為短芽孢桿菌 Brevibacillus shida，23 bp代表微桿菌Microbacterium orla，18 bp代表的微生物可能是固氮弧菌Azoarcus indigen或者霍氏鮑特菌Bordetella holmesii。投加NOB 48 h后，硝化細(xì)菌在蝦塘水內(nèi)作為優(yōu)勢(shì)菌存在，從而可以確保對(duì)水中的亞硝酸鹽持續(xù)降解的作用。

3 結(jié)論

在硝化細(xì)菌生長(zhǎng)遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期取樣，分別進(jìn)行T_RFLP檢測(cè)，當(dāng)反應(yīng)器中硝化細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)菌多樣性最低，富集培養(yǎng)效果最高。添加穩(wěn)定期硝化細(xì)菌至蝦塘水中，從T_RFLP檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，投加硝化細(xì)菌前蝦塘水內(nèi)的細(xì)菌多樣性小于投加后，并且硝化細(xì)菌可以作為優(yōu)勢(shì)菌存在于養(yǎng)殖水體中，利用T_RFLP技術(shù)對(duì)硝化細(xì)菌生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的硝化細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而尋找富集最佳時(shí)機(jī)進(jìn)行投加，提高了硝化細(xì)菌的產(chǎn)業(yè)化效率。T_RFLP技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合，能夠?qū)Νh(huán)境中的微生物多樣性進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，是一種比較靈敏的微生物生態(tài)學(xué)研究方法。

REFERENCES

[1] Liu F, Wang M, Yang H, et al. Screening and Identification of purple non-sulfur photosynthetic bacteria purifying aquaculture water. Chin J Biotech, 2008, 28(8): 91?95.劉芳, 王敏, 楊慧, 等. 凈化養(yǎng)殖水體紫色非硫光合細(xì)菌的篩選與鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 28(8): 91?95.

[2] Wang LG, Ren TZ, Wang YC, et al. Effect of seaweed extract on nitrogen cycle in eutrophic water. Environ Sci Technol, 2006, 29(2): 14?17.王立剛, 任天志, 王迎春, 等. 海藻提取物對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體氮素循環(huán)影響研究. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2006, 29(2): 14?17.

[3] Ju Z, Zhou CL, Dou J. Studies on the culture and application of a nitrite-oxidizing bacterium with high hitrification activity. Microbiol China, 2005, 32(5): 56?61.琚姝, 周長(zhǎng)林, 竇潔. 高硝化活性亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的培養(yǎng)和應(yīng)用研究. 微生物學(xué)通報(bào), 2005, 32(5): 56?61.

[4] Hu JL, Lin XG, Zhu HY, et al. Isolation of soil ammonia-oxidizing bacteria. Soils, 2005, 37(5): 569?571.胡君利, 林先貴, 褚海燕, 等. 土壤氨氧化菌的分離方法研究. 土壤, 2005, 37(5): 569?571.

[5] Luo JF, Lin WT, Ren J, et al. T_RFLP technique and its application on community analysis of nitrifying bacteria. Microbiol China, 2008, 35(3): 456?461.羅劍飛, 林煒鐵, 任杰, 等. T_RFLP技術(shù)及其在硝化細(xì)菌群落分析中的應(yīng)用. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(3): 456?461.

[6] Yu SL, Wu XL, Qian Y. Application and optimization of T_RFLP method for microbial community analysis. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12(6): 861?868.余素林, 吳曉磊, 錢(qián)易. 環(huán)境微生物群落分析的T_RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12(6): 861?868.

[7] Fe′ray C, Volat B, Degrange V, et al. Assessment of three methods for detection and quantifcation of nitriteoxidizing bacteria and nitrobacter in freshwater sediments (MPN-PCR, MPN-Griess, immunofuorescence). Microb Ecol, 1999, 37(3): 208?217.

[8] Leser TD, Lindecrona RH, Jensen TK, et al. Changes in bacterial community structure in the colon of pigs fed different experimental diets and after infection with brachyspira hyodysenteriae. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(8): 3290?3296.

[9] Peinhopf M, Rijnen L, Bockelmann W, et al. The surface microfora dynamics of bacterial smear-ripened Tilsit cheese determined by T_RFLP DNA population fngerprint analysis. Int Dairy J, 2005, 15(6/9): 785?794.

[10] Wen QX, Chen ZQ, Shi HC. T_RFLP detection of nitrifying bacteria in a fuidized bed reactor of achieving simultaneous nitrifcation-denitrifcation. Chemosphere, 2008, 71(9): 1683?1692.

[11] Terahara T, Hoshino T, Tsuneda S, et al. The microbial population dynamics at the start-up stage of wastewater treatment reactor by terminal restriction fragment length polymorphism analysis based on 16S rDNA and rRNA gene sequences. J Biosci Bioeng, 2004, 98(6): 425?428.

Analysis of microbial diversity of nitrifying bacteria by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

Weitie Lin, and Yanan Zhu
School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China

We analyzed the microbial diversity and quantity of nitrifying bacteria in the enrichment reactor by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T_RFLP), a cultured-independent molecular technique. The result indicated that nitrobacteria enriched the best, and the diversity index decreased 62.80% compared with the initial data. Nitrobacteria were predominant in the reactor. Meanwhile, we studied the microbial diversity before and after adding Nitrobacteria into shrimp ponds, and analyzed several major bacterial species that existed stably in the pond. According to the analysis by T_RFLP program, species including Brevibacillus brevis, Microbacterium lactium, Azoarcus indigens and Bordetella holmesii were the dominant bacteria in the ponds.

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, nitrobacter, reactor, microbial community structure, microbial diversity

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖密度的大幅提高，養(yǎng)殖過(guò)程中廣泛使用的餌料、抗生素以及產(chǎn)生的大量水生物排泄物對(duì)水體造成了嚴(yán)重污染，引發(fā)了一系列的養(yǎng)殖環(huán)境及食品安全問(wèn)題[1]。其中，高濃度的亞硝酸鹽是引起魚(yú)蝦患病甚至死亡的主要因素，硝化細(xì)菌 (Nitrobacter，NOB) 能夠通過(guò)氧化還原作用將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成無(wú)毒的硝酸鹽[2]。因此，通過(guò)投加硝化細(xì)菌可以有效避免亞硝酸鹽的毒害。目前，由于硝化細(xì)菌代時(shí)長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢、平板培養(yǎng)菌落較小易受雜菌污染，因此，對(duì)其研究主要停留在傳統(tǒng)的菌種分離、純化和生理生化特性的基礎(chǔ)上[3-4]，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)硝化細(xì)菌富集生物反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌活性的準(zhǔn)確研究，不利于硝化細(xì)菌投加菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

December 23, 2009; Accepted: February 26, 2010

Weitie Lin. E-mail: wtlin@21cn.com