楚元奎，呂長(zhǎng)榮，陳冬梅，曹暉，竇忠英

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心陜西分中心，楊凌 712100

神經(jīng)元素3基因 (neurogenin3，ngn3) 是控制胰島早期發(fā)育的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子之一，它通過與胰島素基因增強(qiáng)子元件結(jié)合，在胰腺的發(fā)育過程中起著非常重要的調(diào)控作用。胚胎發(fā)育生物學(xué)研究表明，胰腺內(nèi)表達(dá) ngn3基因的細(xì)胞可分化為胰島內(nèi)所有四種類型的內(nèi)分泌細(xì)胞，被認(rèn)為是胰島內(nèi)分泌祖細(xì)胞的標(biāo)志之一[1]。外源性ngn3基因的表達(dá)可以促進(jìn)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞向胰島 β細(xì)胞轉(zhuǎn)化[2]。由此可見，導(dǎo)入外源性ngn3基因可作為促進(jìn)干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞分化的一種有效策略。

本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事胰腺祖細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為胰島 β細(xì)胞方面的研究，已成功建立了表達(dá)胰腺十二指腸同源框 1基因 (pancreatic duodenal homeobox-1，pdx-1) 的人胎兒胰腺祖細(xì)胞系，并完成了相關(guān)的鑒定工作和初步誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)[3-4]。本研究旨在建立穩(wěn)定表達(dá)人ngn3基因的包裝細(xì)胞株，將其應(yīng)用于隨后人胎兒胰腺祖細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為胰島 β細(xì)胞的研究中，以期能夠提高其定向誘導(dǎo)分化效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和人胎兒胰腺組織

PT67細(xì)胞由本中心保存；胰腺組織取自5~6月齡人流產(chǎn)胎兒 (楊凌示范區(qū)某醫(yī)院提供)，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種與載體

大腸桿菌DH5α菌種、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-neo由本中心保存；pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hpa I、T4 DNA連接酶、LA Taq聚合酶 (帶2×GC Buffer I)、dNTPs、DL2000 DNA Marker和DNA Marker IV購(gòu)自TaKaRa 公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自Fermentas公司；Trizol Reagent和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen 公司；G418、DMEM培養(yǎng)基 (高糖) 與胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司；DNA片段快速膠回收試劑盒購(gòu)自Bio Dev-tech公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Sangon 公司；高純度質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自Promega 公司；Ngn3鼠多克隆抗體購(gòu)自 Abcam公司 (Lot No：ab54743)；SP-9000通用型免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人 ngn3 基因的克隆與測(cè)序

根據(jù)已發(fā)表人 ngn3基因序列 (GenBank Accession No. BC126468)，應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物。上游引物 hNgn3-F：5′-CCGG AATTC ATGACGCCTCAACCCTCGG-3′，下游引物hNgn3-R：5′-CCGGTTAACTCACAGAAAATCTGA GAAAGCCAG-3′，在上下游引物的 5′端分別引入EcoR I與Hpa I的酶切位點(diǎn)，并加入保護(hù)堿基，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，下劃線部分分別為EcoR I和Hpa I的酶切位點(diǎn)。用Trizol試劑提取5~6月齡人流產(chǎn)胎兒胰腺組織總 mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以hNgn3-F與hNgn3-R為引物，在LA Taq酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，各組分添加比例參照 2×GC Buffer I使用說明。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，67℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為663 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段快速膠回收試劑盒回收后，連接到pMD18-T載體上 (命名為 T-ngn3)，轉(zhuǎn)化后小量提取該質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送TaKaRa 生物公司進(jìn)行測(cè)序。用BioXM 2.6軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果序列與 GenBank中的原序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.2 pMSCV-ngn3重組載體的構(gòu)建

用內(nèi)切酶EcoR I和Hpa I將pMSCV-neo質(zhì)粒和測(cè)序正確的T-ngn3質(zhì)粒雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切后的 pMSCV-neo載體片段(約 6.5 kb) 和ngn3基因片段，用T4 DNA連接酶連接后得到pMSCV-ngn3重組載體，重組載體經(jīng)轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取后，進(jìn)行EcoR I和Hpa I雙酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送出測(cè)序。大量提取測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒，測(cè)定其核酸濃度，?20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PT67包裝細(xì)胞G418最小致死量的測(cè)定

將PT67細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種24孔板，每孔分別加入含0、100、200、300、400、500、600、700 mg/L G418的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度梯度作3孔重復(fù)。期間每 3天換液1次，培養(yǎng)2周后，所有細(xì)胞全部死亡的孔所對(duì)應(yīng)的G418濃度即是PT67細(xì)胞的G418最小致死量。

1.2.4 PT67-ngn3包裝細(xì)胞株的建立

PT67包裝細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液為含 15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞每3天按 1∶5的比例傳代1次。轉(zhuǎn)染前1天將PT67細(xì)胞按 2×105個(gè)/皿的密度接種于直徑為60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后用于轉(zhuǎn)染 (約 70%~80%融合)。用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將pMSCV-ngn3質(zhì)粒導(dǎo)入PT67細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h換成含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后按1∶10的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代后24 h更換為G418篩選液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選2周后得到許多具有G418抗性的細(xì)胞克隆 (命名為PT67-ngn3細(xì)胞)。擴(kuò)增培養(yǎng)后對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行免疫組化和 RT-PCR鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)上清液進(jìn)行RT-PCR鑒定以及透射電鏡觀察。

1.2.5 包裝細(xì)胞株及其培養(yǎng)上清液的RT-PCR檢測(cè)

應(yīng)用 Trizol試劑提取包裝細(xì)胞株及其培養(yǎng)上清液中的總RNA，總RNA經(jīng)DNase I處理后，以O(shè)ligo (dT)18為引物用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，取1 μL cDNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)引物為hNgn3-F/hNgn3-R。反應(yīng)體系及參數(shù)同上。以未轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞做陰性對(duì)照。

1.2.6 包裝細(xì)胞株的免疫組化檢測(cè)

參照 SP-9000通用型免疫組化染色試劑盒說明對(duì)篩選前及篩選后的 PT67-ngn3包裝細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。一抗為鼠抗 Ngn3多克隆抗體(1∶200倍稀釋)，二抗為生物素標(biāo)記的抗鼠多克隆抗體，DAB顯色，鏡下觀察照相。并對(duì)G418篩選前后的Ngn3陽性細(xì)胞率進(jìn)行比較分析。200倍鏡下分別隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)Ngn3陽性細(xì)胞數(shù)，與總細(xì)胞數(shù)比較后得到Ngn3陽性細(xì)胞率，取其平均值進(jìn)行分析。

1.2.7 包裝細(xì)胞株培養(yǎng)上清液中病毒顆粒的透射電鏡觀察

將?70℃保存的培養(yǎng)上清液取出，25 000 r/min離心90 min濃縮后，迅速置于冰盒內(nèi)，送往第四軍醫(yī)大學(xué)電鏡室進(jìn)行觀察檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 人ngn3基因的克隆與測(cè)序

以流產(chǎn)人胎兒胰腺組織獲得的cDNA為模板，hNgn3-F/hNgn3-R為引物進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見大小約663 bp的特異性條帶 (圖1)。PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BioXM 2.6軟件分析與GenBank公布的人 ngn3基因序列 (GenBank Accession No. BC126468) 完全相同。

2.2 pMSCV-ngn3重組載體的鑒定

將pMSCV-ngn3重組載體用EcoR I和Hpa I進(jìn)行雙酶切，結(jié)果得到663 bp和6.5 kb兩個(gè)酶切片段(圖 2)，且測(cè)序結(jié)果證實(shí) ngn3基因序列未發(fā)生突變。該結(jié)果證明人ngn3基因重組到了pMSCV-neo載體中。

圖1 人ngn3基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of human ngn3 gene PCR products. M: DL2000 marker; 1: human ngn3 gene PCR products.

圖2 pMSCV-ngn3重組載體的雙酶切鑒定Fig. 2 Detection of pMSCV-ngn3 recombinant vector by double restriction enzyme digestion. M: DNA marker IV; 1: double restriction enzyme digestion products of pMSCV-ngn3 recombinant vector.

2.3 PT67-ngn3包裝細(xì)胞株的建立及鑒定

PT67 細(xì)胞經(jīng)不同濃度G418篩選，確定其最小致死濃度為 600 mg/L，選取該濃度的G418用于隨后的細(xì)胞篩選。將pMSCV-ngn3重組載體導(dǎo)入PT67細(xì)胞內(nèi)，傳代后待細(xì)胞生長(zhǎng)至 70%~80%融合時(shí)進(jìn)行G418篩選 (圖3A)。篩選3 d后細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，第6天時(shí)局部出現(xiàn)小的細(xì)胞克隆 (圖3B)，隨著篩選的繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞克隆逐漸增大 (圖3C、D)。2周后停止篩選，對(duì)其進(jìn)行傳代擴(kuò)增及相關(guān)檢測(cè)，將擴(kuò)增后的細(xì)胞株命名為PT67-ngn3細(xì)胞株。

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞內(nèi)有目的基因ngn3的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞內(nèi)則檢測(cè)不到該基因表達(dá) (圖 4)。表明導(dǎo)入的目的基因在包裝細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄。

免疫組化結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞內(nèi)有目的蛋白Ngn3的表達(dá)，其定位于細(xì)胞核內(nèi) (圖5)，并且經(jīng)過 G418篩選，Ngn3陽性細(xì)胞率由篩選前的34.8%增加到了 78.7% (圖 6)。表明目的基因轉(zhuǎn)錄后翻譯成了蛋白，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)；該包裝細(xì)胞株經(jīng)過G418篩選得到了進(jìn)一步的純化。

對(duì) G418篩選后的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)和透射電鏡分析。透射電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)上清液中含有包裝后的病毒顆粒，該病毒顆粒呈圓形或橢圓形，具有典型的病毒顆粒形態(tài) (圖 7箭頭所示)；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，包裝后的病毒顆粒中含有目的基因 (圖4)。

圖3 PT67-ngn3包裝細(xì)胞株的篩選Fig. 3 Screening of PT67-ngn3 packaging cells. (A) Before screening. (B) 6 days after screening. (C) 11 days after screening. (D) 14 days after screening. A, B magnificating 100×; C, D magnificating 50×.

圖4 PT67-ngn3包裝細(xì)胞株及其培養(yǎng)上清液的RT-PCR檢測(cè)Fig. 4 RT-PCR detection of PT67-ngn3 packaging cells and its supernatant. M: DL2000 DNA marker; 1: RT-PCR products of PT67-ngn3 packaging cells; 2: RT-PCR products of PT67-ngn3 packaging cells’s supernatant; 3: RT-PCR products of PT67 cells.

圖5 PT67-ngn3包裝細(xì)胞G418篩選前及篩選后的免疫組化染色 (Ngn3陽性細(xì)胞為核著色，如箭頭所示，200×)Fig. 5 Immunohistochemical staining of PT67-ngn3 packaging cells before and after G418 screening. (A) Immunohistochemical staining of PT67-ngn3 packaging cells before G418 screening. (B) Immunohistochemical staining of PT67-ngn3 packaging cells after G418 screening. (Ngn3 positive cells are nucleus coloring, black arrows, magnificating 200×).

圖6 G418篩選前后Ngn3陽性細(xì)胞的表達(dá)變化Fig. 6 Analysis of Ngn3 positive cell expression before and after G418 screening. a: Ngn3 positive cell rate before G418 screening; b: Ngn3 positive cell rate after G418 screening.

圖7 pMSCV-ngn3逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒在透射電鏡下的形態(tài) (100 000×，箭頭所示)Fig. 7 Morphology of retroviral pMSCV-ngn3 particles under transmission electron microscope. Magnificating 100 000×, black arrows.

以上結(jié)果綜合表明，PT67-ngn3包裝細(xì)胞株建立成功。

3 討論

近些年來，干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為功能性的胰島素分泌細(xì)胞主要是采取添加可溶性誘導(dǎo)因子的方式，已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是仍然存在誘導(dǎo)分化效率不高，細(xì)胞未完全成熟分化等問題[5-6]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，將與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育和 β細(xì)胞分化以及功能完善相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)用于干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化迅速成為了研究的熱點(diǎn)，并為提高干細(xì)胞向胰島 β細(xì)胞的分化效率提供了新的途徑。近幾年，pdx-1、ngn3和mafa等胰腺轉(zhuǎn)錄因子在該領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)取得了一些可喜的進(jìn)展[7-8]。本實(shí)驗(yàn)選用的 ngn3基因?qū)儆趬A性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH) 結(jié)構(gòu)型轉(zhuǎn)錄因子，是啟動(dòng)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是 β細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子neuroD的激活因子[9]。ngn3通過啟動(dòng)下游一系列相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而在胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的定向分化過程中發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)從流產(chǎn)人胎兒胰腺組織成功克隆出了人ngn3基因開放閱讀框序列，其測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的人 ngn3基因序列 (GenBank Accession No. BC126468) 完全相同，與之前所用的普通Taq聚合酶和Buffer相比，GC buffer I和LA Taq聚合酶的應(yīng)用不僅大大提高了擴(kuò)增效率，而且得到了高度保真的人ngn3基因。這主要是由于ngn3基因是通過與胰島素基因增強(qiáng)子元件結(jié)合來發(fā)揮作用的，其本身具有很高的 GC含量，因此對(duì)擴(kuò)增條件的要求也較高，GC buffer I和LA Taq聚合酶的應(yīng)用很好地解決了這一問題。

實(shí)驗(yàn)中所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMSCV-neo來源于 Moloney小鼠白血病病毒，擁有鼠干細(xì)胞PCMV病毒來源的5′長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (5′ LTR)，可使目的基因在干細(xì)胞和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)[10]。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-neo本身不具有感染能力，其感染能力需要經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝才能獲得。實(shí)驗(yàn)中所用的PT67細(xì)胞是目前較為廣泛使用的包裝細(xì)胞，用它制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以感染人和其他哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，并且由它包裝的病毒感染靶細(xì)胞后不能進(jìn)行復(fù)制，因此具有很高的生物安全性[11]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出了表達(dá)人ngn3基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMSCV-ngn3，通過脂質(zhì)體法將其導(dǎo)入PT67包裝細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)G418篩選后，得到1株具有G418抗性的細(xì)胞株，RT-PCR及免疫組化檢測(cè)證實(shí)該細(xì)胞株在mRNA水平和蛋白水平均穩(wěn)定表達(dá)Ngn3，表明PT67-ngn3包裝細(xì)胞株建立成功。對(duì)其培養(yǎng)上清液的RT-PCR檢測(cè)及電鏡觀察結(jié)果表明，該包裝細(xì)胞株將導(dǎo)入的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-ngn3包裝成了具有感染能力的病毒顆粒，并將其釋放到了培養(yǎng)上清液中，表明得到的細(xì)胞株為高效表達(dá)人ngn3基因的產(chǎn)毒細(xì)胞株。

總之，PT67-ngn3高效產(chǎn)毒包裝細(xì)胞株的成功建立，為下一步將ngn3基因應(yīng)用于人胎兒胰腺祖細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化，提高其定向誘導(dǎo)效率奠定了基礎(chǔ)。

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