廖宇潔 鄔海翔 徐格致 張萌 樊嘉雯 蔣婷婷 王文韜

視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜的免疫細(xì)胞，可以有多種狀態(tài)，執(zhí)行多種功能[1]，其數(shù)量和形態(tài)可發(fā)生變化，合成并釋放多種細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)趨化因子以 及神經(jīng)營養(yǎng)因子等[2]，影響疾病的發(fā)生發(fā)展過程。近年來關(guān)于視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性疾病中作用的研究較多，但對于小膠質(zhì)細(xì)胞與血管疾病的關(guān)系所知甚少。本文探索性地研究活化的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和ZO-1表達(dá)的影響，以初步了解活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是否可能影響屏障功能。

1 材料與方法

1.1 材料 出生2～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠(雌雄不限，符合國家醫(yī)用動物使用標(biāo)準(zhǔn)，清潔級)，購自中國科學(xué)院。0.25%胰酶加0.02%依地酸二鈉，多聚D賴氨酸和4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽購自美國Sigma公司。Hank’s平衡鹽液(Hank′s balanced salt solution ，HBSS)和胎牛血清購自美國Gibco公司。CD68和聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)為美國Millipore公司產(chǎn)品。HUVECs和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)購自美國ScienCell公司。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基混合營養(yǎng)素F12(Dulbecco′s modified eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12)為美國Hyclone公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、Transwell小室和24孔板購自美國Corning公司。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、ZO-1和羊抗鼠二抗購自美國Invitrogen公司。VEGF為英國Abcam公司產(chǎn)品。BCA蛋白濃度測定試劑盒、電泳液和轉(zhuǎn)膜液購自碧云天生物技術(shù)研究所。主要儀器為化學(xué)發(fā)光影像分析儀LAS4000 和Leica熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定 參照文獻(xiàn)[3-4]的方法。出生2～3 d的清潔級SD大鼠斷頭處死，碘伏浸泡5 min，無菌條件下取出眼球，在預(yù)冷的無鈣鎂的HBSS中漂洗3次，取出視網(wǎng)膜并剪碎，加入0.25%胰酶加0.02%依地酸二鈉37 ℃消化20 min，用含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的DMEM/F12終止消化，過200目細(xì)胞篩，濾液置于無菌離心管200 ×g離心5 min，棄上清液，細(xì)胞重懸并以1×106/mL接種于多聚D賴氨酸包被過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液，之后每3～4 d加液。14 d時將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床，以20 g/min的速度振搖1 h，收集上清液，200×g離心10 min,沉淀物重新混懸，接種于24孔板，2 h后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗去未貼壁的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min,TritonX-100膜穿孔,PBS清洗后用牛血清白蛋白封閉30 min,加入一抗4 ℃濕房過夜，CD68為1∶200,PBS洗3次后加入羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加入DAPI 2 min，PBS清洗，滴甘油，封片。Leica熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 HUVECs的復(fù)蘇和傳代 液氮中取出HUVECs后37 ℃水浴迅速復(fù)溫，用ECM培養(yǎng)24 h后換液，之后每3 d消化傳代，第4～10代細(xì)胞用于實驗。

1.2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞和HUVECs共培養(yǎng) 小膠質(zhì)細(xì)胞接種于Transwell的上室，2 h后PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，分別用不含血清的DMEM/F12和不含血清但含100 ng/mL LPS的DMEM/F12培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞24 h，PBS洗2次后用于實驗。A組僅在下室接種HUVECs,上室無小膠質(zhì)細(xì)胞，B組上室為未激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，下室為HUVECs，C組上室為100 ng/mL的LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，下室為HUVECs。共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行HUVECs細(xì)胞免疫熒光染色觀察ZO-1的表達(dá),并行Western Blot檢測VEGF 和ZO-1蛋白量。

1.2.4 ZO-1表達(dá)的觀察 小膠質(zhì)細(xì)胞和HUVECs共培養(yǎng)24 h后，A、B和C組的HUVECs用PBS清洗后行細(xì)胞免疫熒光染色，方法和小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定相同，一抗ZO-1為1∶100，對照為PBS代替一抗。

1.2.5 VEGF和ZO-1蛋白量的測定 移去上室，HUVECs用無鈣鎂的HBSS洗2次，加入裂解液用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞并收集，置于冰上20 min，4 ℃，13 000×g離心10 min,取上清液備用。BCA法蛋白定量，取上清液按體積比加入5×上樣緩沖液,99 ℃×3 min蛋白變性。各組取蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，將蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入一抗，VEGF為1∶1 000，ZO-1為1∶500，4 ℃過夜，洗膜，分別加入羊抗鼠和羊抗兔二抗，孵育1 h,再洗膜后用化學(xué)發(fā)光影像分析儀LAS4000獲取圖片結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果采用Stata7.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析，并兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，部分細(xì)胞胞膜上有微小突起(見附1頁圖①和圖②)；LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，突起明顯增多(見附1頁圖③和圖④)。 A組HUVECs緊密連接蛋白ZO-1主要集中在相鄰細(xì)胞的邊界(見附1頁圖⑤)，B組HUVECs的ZO-1也集中于相鄰細(xì)胞之間，但表達(dá)略降低(見附1頁圖⑥)；C組HUVECs的ZO-1表達(dá)明顯減弱，連續(xù)性中斷(見附1頁圖⑦)。免疫印跡檢測VEGF和ZO-1蛋白量變化，蛋白表達(dá)值以β-actin內(nèi)參校正，結(jié)果顯示三組細(xì)胞的ZO-1和VEGF蛋白表達(dá)不全相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)值分別21.2及9.28),C組與A組和B組比較，VEGF蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05，F(xiàn)值分別為0.075及0.061)(見附2頁圖⑧)，ZO-1蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05，F(xiàn)值分別為0.12及0.07) (見附2頁圖⑨)。A組和B組比較，ZO-1和VEGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，F(xiàn)值分別為0.04及0.013)。靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體小，部分細(xì)胞胞膜上有微小突起(見附1頁圖①和圖②)；LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，突起明顯增多(見附1頁圖③和圖④)。 A組HUVECs緊密連接蛋白ZO-1主要集中在相鄰細(xì)胞的邊界(見附1頁圖⑤)，B組HUVECs的ZO-1也集中于相鄰細(xì)胞之間，但表達(dá)略降低(見附1頁圖⑥)；C組HUVECs的ZO-1表達(dá)明顯減弱，連續(xù)性中斷(見附1頁圖⑦)。免疫印跡檢測VEGF和ZO-1蛋白量變化，蛋白表達(dá)值以β-actin內(nèi)參校正，結(jié)果顯示三組細(xì)胞的ZO-1和VEGF蛋白表達(dá)不全相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)值分別21.2及9.28),C組與A組和B組比較，VEGF蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.05，F(xiàn)值分別為0.075及0.061)(見附2頁圖⑧)，ZO-1蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05，F(xiàn)值分別為0.12及0.07) (見附2頁圖⑨)。A組和B組比較，ZO-1和VEGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，F(xiàn)值分別為0.04及0.013)。

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在神經(jīng)變性疾病中起著介導(dǎo)神經(jīng)元損傷的作用，視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性疾病如青光眼[5-6]、視網(wǎng)膜色素變性[7]和光感受器損傷[8]等的發(fā)生發(fā)展均與視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有著千絲萬縷的聯(lián)系，因此視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性疾病之間關(guān)系的研究是近年眼科研究的熱點(diǎn)之一。那么在視網(wǎng)膜血管疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞起作用嗎？在對年齡相關(guān)性黃斑變性疾病研究中發(fā)現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)等作用參與了脈絡(luò)膜新生血管的形成[9]。最新的對糖尿病視網(wǎng)膜病變患者尸體眼的病理研究中發(fā)現(xiàn)，在非增殖期和增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的各個階段都可見活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，而且這些小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在視網(wǎng)膜微血管病變的周圍[10]，其作用不知。本研究顯示，LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以引起HUVECs的VEGF表達(dá)上調(diào)，ZO-1表達(dá)下調(diào)，可能影響屏障功能。

血視網(wǎng)膜屏障的破壞與視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可引起血管的滲漏和視網(wǎng)膜水腫。內(nèi)層血視網(wǎng)膜屏障的功能與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junction,TJ)構(gòu)成相關(guān)，血管內(nèi)皮緊密連接的特定蛋白的解體會造成內(nèi)層血視網(wǎng)膜屏障的破壞。ZO-1是最早發(fā)現(xiàn)的TJ蛋白，存在于多種器官的血液屏障中，ZO-1蛋白表達(dá)異常會直接導(dǎo)致TJ破壞，屏障功能受損[11-12]。另外，VEGF也是公認(rèn)的影響血視網(wǎng)膜屏障功能的細(xì)胞因子。因此，我們將ZO-1和VEGF 作為檢測指標(biāo)來了解小膠質(zhì)細(xì)胞對屏障功能的可能影響。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HUVECs與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時，活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞作用于HUVECs使VEGF表達(dá)上調(diào)，且 ZO-1的表達(dá)下調(diào)，而空白對照組幾乎無作用。說明活化的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過促進(jìn)VEGF表達(dá)的上調(diào)和ZO-1表達(dá)的下調(diào)破壞屏障功能。小膠質(zhì)細(xì)胞易受微環(huán)境影響，可以有多種狀態(tài)并執(zhí)行多種功能，因此對于其在血管病變致病機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步深入研究。

[1]LYNCH M A.The multifaceted profile of activated microglia[J].Mol Neurobiol,2009,40(2)：139-156.

[2]HANISCH U K,KETTENMANN H.Microglia:active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain[J].Nat Neurosci,2007,10(11):1387-1394.

[3]ROQUE R S,CALDWELL R B.Isolation and culture of retinal microglia[J].Curr Eye Res,1993，12(3):285-290.

[4]王愛玲，柳林，朱秀安，等.視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型的建立[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2005，37(2)：198-200.

[5]NEUFELD A H.Microglia in the optic nerve head and the region of parapapillary chorioretinal atrophy in glaucoma[J].Arch Ophthalmol,1999,117(8):1050-1056.

[6]岳紅云，賀翔鴿，燕振國.慢性高眼壓SD大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b表達(dá)研究[J].中華眼科雜志，2009，45(4)：356-360.

[7]曾惠陽，曹安民，朱秀安.小膠質(zhì)細(xì)胞在人原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性中的活化[J].眼科研究，2008，26(2)：129-132.

[8]NI Y Q,XU G Z,HU W Z,et al.Neuroprotective effects of naloxone against light-induced photoreceptor degeneration through inhibiting retinal microglia activation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(6):2589-2598.

[9]MA W，ZHAO L,FONTAINHAS A M,et al.Microglia in the mouse retina alter the structure and function of retinal pigmented epithelial cells: a potential cellular interaction relevant to AMD[J].PLoS One,2009,4(11):e7945.

[10]ZENG H Y,GREEN W R,TSO M O.Microglial activation in human diabetic retinopathy[J].Arch Ophthalmol,2008，126(2):227-232.

[11]唐宇平，蔡定芳，劉軍，等.急性腦出血血腫周圍組織水通道蛋白-4表達(dá)與血腦屏障損傷的關(guān)系[J].中華神經(jīng)科雜志，2005，38(11)：704-708.

[12]陳振勇,馮賢松,周有生.梗阻性黃疸大鼠腸黏膜上皮緊密連接蛋白和MLCK的研究[J].中國普通外科雜志，2008，17(2)：140-144.