王江濤，王捷

綜述

光學(xué)成像在腫瘤骨轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王江濤，王捷

骨腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；體層攝影術(shù)，光學(xué)

目前對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的影像學(xué)評(píng)估主要依靠SPECT、PET、X線和微CT等顯像技術(shù)，這些影像模式在空間分辨率、敏感性及信號(hào)定量方面都有自己的優(yōu)勢。然而，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，不僅有骨組織結(jié)構(gòu)的改變，還有血管再生、腫瘤間質(zhì)的相互作用、宿主免疫反應(yīng)等病理生理變化。近十幾年來，隨著光學(xué)成像探針及成像模式的不斷發(fā)展，光學(xué)成像技術(shù)已成為腫瘤臨床前實(shí)驗(yàn)研究必不可少的一種分子影像評(píng)估手段，它能夠?qū)δ[瘤的生長、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、血管再生、細(xì)菌感染、局部酶活性等進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測及定量分析[1-3]，從而為腫瘤骨轉(zhuǎn)移提供功能性信息，現(xiàn)綜述如下。

1 全身光學(xué)成像——技術(shù)和設(shè)備

所有的光學(xué)成像都是基于對(duì)活細(xì)胞組織或者動(dòng)物發(fā)出的光子進(jìn)行檢測。活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光（bioluminescence imaging，BLI)和熒光發(fā)光（fluorescence imaging，F(xiàn)LI）兩種技術(shù)。二者在靈敏度、信噪比、組織來源的背景等方面各不相同。檢測時(shí)選用BLI還是FLI主要取決于細(xì)胞標(biāo)記物；此外，BLI成像技術(shù)可以檢測細(xì)胞的新陳代謝，而FLI成像技術(shù)則可觀察體內(nèi)外所有的組織細(xì)胞。

1.1 BLI成像技術(shù)

BLI成像具有背景低、信噪比高、無創(chuàng)、檢測時(shí)間短、可同時(shí)檢測多個(gè)動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合生命科學(xué)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究。

BLI成像中最常使用的熒光素酶是從螢火蟲中提取的。螢火蟲發(fā)光細(xì)胞中含有熒光素和熒光素酶兩種發(fā)光物質(zhì)，它們與ATP、氧發(fā)生反應(yīng)，在氧與熒光素結(jié)合時(shí)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，引起能量變化，釋放熒光光子而發(fā)光。由于需要活性氧的參與，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)出現(xiàn)熒光，光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目呈線性相關(guān)；發(fā)射光譜較寬，峰值在560 nm附近。其他可用的熒光素酶是從珊瑚、水母、紅色或綠色的叩頭蟲以及一些細(xì)菌物種中克隆出來的。這些綠色或紅色的熒光素酶被氧化后發(fā)射出綠光（544 nm）或紅光（611 nm）[4]。有學(xué)者最近在對(duì)螢火蟲和叩頭蟲提取的熒光素進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上制備出耐熱的熒光素酶，并證實(shí)其可分辨體內(nèi)和體外的綠色和紅色熒光信號(hào)[5-6]。來自珊瑚蟲、海洋叩頭蟲的熒光素酶同腔腸素反應(yīng)（不依賴ATP）可發(fā)出藍(lán)光，發(fā)射光最大峰值480 nm。盡管這些酶發(fā)射光波長較短，分布局限，腔腸素在小動(dòng)物體內(nèi)流動(dòng)較快，但已有研究證實(shí)其在體內(nèi)分子診斷方面非常有效[7]。

使用熒光素酶作為體內(nèi)成像的工具，特別是對(duì)動(dòng)物組織的深部進(jìn)行成像時(shí)，組織穿透性、光散射及組織自發(fā)熒光都是影響成像的重要因素。波長越長則自發(fā)熒光就越低；同綠光相比，近紅外光幾乎不引起自發(fā)熒光；而且光滲透性、組織吸收及散光等現(xiàn)象都會(huì)減弱[8]。需要強(qiáng)調(diào)的是，由于細(xì)胞株不同，不管是表達(dá)螢火蟲熒光素酶還是Gaussia熒光素酶，它們都不會(huì)與所對(duì)應(yīng)的底物熒光素和腔腸素發(fā)生交叉反應(yīng)，因此可以利用這一屬性對(duì)所有荷瘤動(dòng)物進(jìn)行全血微量生化分析[9]。

1.2 FLI成像技術(shù)

FLI成像費(fèi)用低廉、操作簡單，熒光信號(hào)遠(yuǎn)強(qiáng)于BLI，而信噪比卻遠(yuǎn)低于BLI。

與BLI不同，F(xiàn)LI不需要底物的參與，但需要外部激發(fā)光源，且自身熒光的強(qiáng)度隨著目標(biāo)深度的增加呈指數(shù)級(jí)的遞減。FLI有多種發(fā)光方式，既可將熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP，Cyt及dyes等）或其突變體基因整合到細(xì)胞染色體上以表達(dá)熒光蛋白，在激發(fā)光源的作用下發(fā)光；也可利用一些熒光基團(tuán)標(biāo)記特定的物質(zhì)，注入小動(dòng)物體內(nèi)而發(fā)光[10]。

活體FLI成像技術(shù)有3種標(biāo)記方法：（1）熒光蛋白標(biāo)記：適用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。目前已研發(fā)出發(fā)射光譜可達(dá)649 nm的熒光蛋白，具有背景低、組織穿透力高的特性，如從突變的蔬菜和奶嘴?？刑崛〉募t移蛋白[11]；而最新從哺乳動(dòng)物體內(nèi)提取的熒光蛋白——基于細(xì)菌的光敏色素，其激發(fā)光波長可達(dá)700 nm[12]。（2）熒光染料標(biāo)記：與體外標(biāo)記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標(biāo)記抗體、多肽、小分子藥物等。（3）量子點(diǎn)標(biāo)記：作為一種新的標(biāo)記方法，量子點(diǎn)標(biāo)記具有熒光發(fā)光光譜窄、量子產(chǎn)率高、不易漂移、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)、光化學(xué)穩(wěn)定性高以及不易分解等諸多優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，尺寸在100 nm以下，外觀恰似一極小的點(diǎn)狀物，可經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，而不像有機(jī)熒光染料那樣易發(fā)生熒光淬滅。其發(fā)射光強(qiáng)度是有機(jī)熒光染料的20倍，穩(wěn)定性較有機(jī)熒光染料強(qiáng)100倍以上。已有研究證實(shí)，量子點(diǎn)成像的深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過標(biāo)準(zhǔn)的熒光素，如果能與抗體結(jié)合配對(duì)，則可作為跟蹤組織細(xì)胞的探針或用以探測低濃度的抗體。而如能解決不同材料的量子點(diǎn)偶聯(lián)、功能化標(biāo)記問題，就可以用量子點(diǎn)代替很多熒光染料分子[13-14]。

1.3 成像設(shè)備

小動(dòng)物全身光學(xué)成像系統(tǒng)近幾年得到快速發(fā)展，但大多數(shù)BLI系統(tǒng)只能進(jìn)行半定量檢測，空間分辨率也不高。最近研發(fā)的BLI斷層成像系統(tǒng)通過提高空間分辨率來實(shí)現(xiàn)三維成像，同時(shí)還能提供定量信息[15]，此外，3D BLI和3D FLI數(shù)據(jù)的采集及后續(xù)重建還可獲得解剖學(xué)、功能信息及分子信息。Nahrendorf等[16]將PET、微CT和3D生物發(fā)光組合，可同時(shí)檢測骨骼結(jié)構(gòu)以及腫瘤的整合蛋白、組蛋白酶活性和巨噬細(xì)胞含量。而通過光譜分離技術(shù)建立的新型熒光發(fā)光系統(tǒng)則可捕獲每個(gè)圖像的光譜信息，去除背景熒光后還能區(qū)分多種熒光標(biāo)記，反映同一張圖片不同的光譜信息[17]。

2 腫瘤骨轉(zhuǎn)移的光學(xué)成像檢查

在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤和周圍微環(huán)境的互相作用介導(dǎo)原發(fā)灶血管生成及自身免疫系統(tǒng)激活，從而獲得免疫抑制以利于腫瘤的生長；此外，骨轉(zhuǎn)移灶通常是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞失衡之處，使腫瘤細(xì)胞易于在此生長。而光學(xué)成像系統(tǒng)的特點(diǎn)使其可以對(duì)骨骼、腫瘤、腫瘤和間質(zhì)的反應(yīng)、血管生成及生成前信號(hào)通路等的變化進(jìn)行光學(xué)成像以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的評(píng)估和檢測[18-19]。以往腫瘤光學(xué)成像技術(shù)發(fā)展中遇到的問題是腫瘤細(xì)胞通常沒有特異的光學(xué)物質(zhì)使之與正常組織區(qū)分開來，但近年來照相檢測系統(tǒng)的發(fā)展使全身光學(xué)成像技術(shù)同樣可以用于細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究；同時(shí)，隨著熒光分子斷層成像（fluorescence molecular tomography，F(xiàn)MT）、3D FLI及3D BLI信息采集技術(shù)的發(fā)展，不僅可以針對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移病人收集3D光學(xué)數(shù)據(jù)，還可結(jié)合其他影像學(xué)工具（如微CT，PET，SPECT，MRI）進(jìn)行后處理，從而使光學(xué)成像成為一種新型的腫瘤骨轉(zhuǎn)移成像平臺(tái)。

2.1 骨組織光學(xué)成像用特異性探針

目前有很多商品化的骨組織檢測特異探針，如VisEn公司研發(fā)的OsteoSense和LI-COR公司研發(fā)的BoneTag，其中OsteoSense-680的激發(fā)光波長為680 nm，發(fā)射光為700 nm；OsteoSense-750的激發(fā)光波長為 750 nm，發(fā)射光為 780 nm；BoneTag-680的激發(fā)光波長為680 nm，發(fā)射光為705 nm；BoneTag-800的激發(fā)光波長為774 nm，發(fā)射光為789 nm。探針可與骨基質(zhì)結(jié)合數(shù)天或數(shù)周，沒有結(jié)合的探針將被洗脫，從而顯示激活區(qū)域特異的發(fā)射熒光信號(hào)動(dòng)態(tài)。需要注意的是，由于探針的半衰期較長，結(jié)合到骨基質(zhì)上將限制重復(fù)測量的結(jié)果。Kozloff等[20]注射不同濃度的OsteoSense-750以驗(yàn)證其在體內(nèi)吸收的線性關(guān)系，結(jié)果顯示，當(dāng)注射劑量達(dá)到100 nmol/kg時(shí)，股骨遠(yuǎn)端的平均熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。

用于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞標(biāo)記和檢測的靶向熒光探針主要有EGF-800CW和2DG-800CW，這兩種探針都可用于轉(zhuǎn)移到骨或其他組織的腫瘤的影像學(xué)檢測。EGF-800CW包含重組表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），可連接到近紅外的熒光燃料IRDye?800CW上；2DG-800CW與2-脫氧葡萄糖結(jié)合，為細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1所識(shí)別。靶向熒光探針識(shí)別后既不參與細(xì)胞代謝也不穿過細(xì)胞膜，只是在細(xì)胞膜上與表達(dá)EGF受體的細(xì)胞選擇性結(jié)合，而EGF受體在很多不同類型的腫瘤細(xì)胞上呈過表達(dá)。此類探針的應(yīng)用無需表達(dá)報(bào)告基因[21-22]。

2.2 骨腫瘤光學(xué)檢測的動(dòng)物模型

骨組織是很多腫瘤（特別是乳腺癌和前列腺癌）的常見轉(zhuǎn)移部位。X線檢查可間接觀察骨轉(zhuǎn)移的溶骨和成骨現(xiàn)象，但無法進(jìn)行微小轉(zhuǎn)移灶的檢測，因此需要更加靈敏的方法。Wetterwald等[23]對(duì)裸鼠心臟注射轉(zhuǎn)染熒光素酶基因的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，制備乳腺癌轉(zhuǎn)移模型，光學(xué)成像系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，注射細(xì)胞3 min后癌細(xì)胞擴(kuò)散至全身各個(gè)部位；15 min后癌細(xì)胞在特定的組織器官如肺、腦、長骨等部位大量聚集；24 h后未檢測到任何細(xì)胞，表明大部分注射的細(xì)胞已死亡；20 d后可在裸鼠長骨的骨髓中觀察到0.5 mm3的微小轉(zhuǎn)移灶，較X線影像檢查提前2周發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。脛骨內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞是制備骨髓腔內(nèi)腫瘤生長模型的最直接方法，可迅速了解腫瘤細(xì)胞在骨組織內(nèi)侵襲生長的情況。在脛骨內(nèi)注射帶有熒光標(biāo)記的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231后1周即可通過BLI技術(shù)檢測到腫瘤細(xì)胞的生長情況，結(jié)合使用微CT進(jìn)行3D重建可以清晰顯示脛骨的溶骨性病變，而放射影像檢測在2周后才發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶[24]。由此可見，光學(xué)成像系統(tǒng)可以較為快速、清楚地觀測到穩(wěn)定表達(dá)熒光素的腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位的生長、侵襲及遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移。除移植轉(zhuǎn)染熒光酶基因的腫瘤細(xì)胞外，有學(xué)者建立帶有熒光素酶基因的自發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，而隨著自發(fā)腫瘤的發(fā)展，腫瘤組織所表達(dá)的熒光素酶也隨之增加[25]。

3 骨轉(zhuǎn)移過程中相關(guān)因子的光學(xué)檢測

基質(zhì)降解、滲透、血管生成在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，阻斷其中任一環(huán)節(jié)都能有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。而光學(xué)成像的最大優(yōu)勢即是對(duì)這些環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化檢測，因此在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的臨床前研究中應(yīng)用光學(xué)成像技術(shù)對(duì)了解腫瘤骨轉(zhuǎn)移作用機(jī)制、尋找預(yù)防腫瘤骨轉(zhuǎn)移方法等都具有非常重要的意義。

3.1 生物因子檢測

轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在骨轉(zhuǎn)移過程中，TGF-β是激活腫瘤細(xì)胞表達(dá)溶骨因子的一個(gè)信號(hào)因子，可導(dǎo)致骨溶解的惡性循環(huán)[26]。通過使用表達(dá)熒光的細(xì)胞株來實(shí)時(shí)檢測TGF-β變化，并將PET、微CT與BLI、FLI技術(shù)相結(jié)合，可以對(duì)干擾TGF-β信號(hào)通路的新型治療方法進(jìn)行有效評(píng)估[27]。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是調(diào)節(jié)血管生成的重要因子，而腫瘤血管生成是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要外部因素。為實(shí)時(shí)檢測VEGF2在體內(nèi)的表達(dá)，Zhang等[28]對(duì)標(biāo)記熒光素酶的VEGFR2轉(zhuǎn)基因小鼠的研究結(jié)果顯示，熒光素與VEGFR2的表達(dá)水平呈正相關(guān)；Backer等[29]使用含有N末端半胱氨酸標(biāo)簽的單鏈VEGF（scVEGF），可用于結(jié)合不同的特定位點(diǎn)；另有研究證實(shí)，基于scVEGF的家族可與腫瘤血管的VEGF受體結(jié)合，標(biāo)記近紅外光染料Cy5.5的scVEGF可用于腫瘤脈管系統(tǒng)VEGF的光學(xué)成像[30]。

αvβ3整合素家族在新生腫瘤脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈高水平表達(dá)，而包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨的酸（RGD）序列的玻璃黏連蛋白可選擇性結(jié)合到αvβ3和αvβ5的受體上，因此標(biāo)記熒光的RGD探針可以檢測αvβ3的表達(dá)水平，將其用于腫瘤、腫瘤脈管系統(tǒng)及破骨細(xì)胞的研究則可檢測到腫瘤的骨轉(zhuǎn)移[31]。商業(yè)化的近紅外熒光探針I(yè)ntegriSense可高度特異性地結(jié)合到陽性內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞αvβ3的表面[32]。

3.2 局部酶活性檢測

測定局部酶活性是觀察基質(zhì)降解和局部炎癥的另一種方法。ProSense是一種酶激活的熒光試劑，是包含多聚賴氨酸骨架、聚乙二醇和一些熒光團(tuán)的大分子，熒光團(tuán)上大分子之間的距離可使熒光信號(hào)淬滅。熒光團(tuán)經(jīng)酶消化后釋放，釋放的熒光團(tuán)不被淬滅，可由活體成像系統(tǒng)檢測到。ProSence通常被組蛋白酶激活，而激活的破骨細(xì)胞表達(dá)組蛋白酶K，導(dǎo)致骨基質(zhì)的降解。組蛋白酶K在溶骨性病變中呈高表達(dá)，Kozloff等[33]運(yùn)用cy5.5標(biāo)記組織蛋白酶K，實(shí)驗(yàn)證實(shí)組蛋白酶的高表達(dá)加速骨溶解進(jìn)程。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移轉(zhuǎn)移、炎癥以及宿主反應(yīng)密切相關(guān)。通過VisEn的專有熒光成像探針平臺(tái)開發(fā)的MMP Sense（TM）探針即是一種能夠反映腫瘤和活體中其他炎癥部位MMP活性的活體分子探針[34]。

4 展望

小動(dòng)物的光學(xué)成像在檢測腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展過程及藥物干預(yù)療效方面是非常實(shí)用有效的手段之一，可以進(jìn)行體內(nèi)實(shí)時(shí)、無創(chuàng)的可視化檢測。其最終目的是將活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用范圍從臨床前實(shí)驗(yàn)研究拓展到臨床檢測研究，從而提高腫瘤骨轉(zhuǎn)移診斷的特異性和敏感性，并進(jìn)一步為其個(gè)體化治療及預(yù)防提供指導(dǎo)。光學(xué)成像技術(shù)與傳統(tǒng)影像學(xué)工具如X線、CT、SPECT、MRI以及病理學(xué)研究相結(jié)合，可以從結(jié)構(gòu)、功能、分子及解剖水平全面評(píng)估腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展、治療效果以及轉(zhuǎn)移灶骨骼、血管、腫瘤大小及分子的功能狀況。但目前光學(xué)成像還面臨一些關(guān)鍵技術(shù)問題需要解決，包括研發(fā)特異性光學(xué)探針、建立特異性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型以及開發(fā)研制更為靈敏的檢測設(shè)備等。

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R738，R445.9

A

1674-666X(2010)04-0302-05

2010-11-05；

2010-11-30）

（本文編輯 白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.04.012

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科

王捷，E-mail：jiew@tom.com