李爾然 王 波 李艷杰 王秋月 康 健

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所,沈陽110001)

肺是氣體交換的場所,肺泡和毛細(xì)血管間水的平衡對保持肺泡內(nèi)相對干燥的環(huán)境并維持正常的氣體交換功能具有重要意義。肺微血管內(nèi)皮(LMEC)通透性增加造成肺水代謝的失衡是急性肺損傷 (ALI)發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。以往人們普遍認(rèn)為肺水腫主要是由于LMEC受損所致,但隨著水通道蛋白AQP1的發(fā)現(xiàn),使人們認(rèn)識到水通道可能在ALI中起到重要作用。目前已知肺部存在四種水通道蛋白 (AQP1,AQP3,AQP4,AQP5),在生理情況下對肺水的轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的作用,但近年來發(fā)現(xiàn)AQP1尚有除轉(zhuǎn)運(yùn)水以外的其它重要功能,如促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運(yùn) CO2及O2等,非常引人注目。我們在離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),作為ALI的重要致病菌,金黃色葡萄球菌 (S.A)及其主要致病因子α-溶血素 (α-Toxin)可顯著影響細(xì)胞AQP1的表達(dá)[1],本研究擬觀察金黃色葡萄球菌α-溶血素致大鼠急性肺損傷時肺AQP1表達(dá)的變化,以探討急性肺損傷時肺水代謝的異常機(jī)制。

材料和方法

1.實(shí) 驗(yàn)動物分組及處理

隨機(jī)將24只190-210g健康雄性 Wistar大鼠(購自中國醫(yī)科大學(xué)動物部)分成兩組即鹽水對照組 (6只)及實(shí)驗(yàn)組 (18只)。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射金葡菌α-Toxin(Sigma公司) (5μg/100g,α-Toxin用生理鹽水稀釋為3μg/ml),鹽水對照組腹腔注射等量的生理鹽水。處理后將實(shí)驗(yàn)組大鼠按照觀察時間隨機(jī)分成3組 (每組6只),即 6h組,10h組及24h組。鹽水對照組觀察24h。

2.標(biāo) 本采集

10%水合氯醛腹腔麻醉 (0.3mg/100g),然后暴露胸腔及腹腔,于腹主動脈抽2ml動脈血,測量動脈血氧分壓 (PaO2)。用 4℃,2‰肝素液100ml從右心室灌流鼠肺,同時剪開左心耳及腹主動脈,進(jìn)行充分血管灌流,直至肺部變白。取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定,制成蠟塊,作成4μm切片,用于 HE及免疫組化染色。取左肺下葉稱濕重 (W)后置于60℃烤箱24h,烤至恒重,稱干重(D),計(jì)算濕干比重 (W/D)。

3.免 疫組化SABC法染色

按照免疫組化試劑盒SABC法操作。標(biāo)本經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟,抗原熱修復(fù),加血清阻斷劑室溫20min,加一抗AQP1抗體 (1:1000)4℃孵育過夜 (抗AQP1一抗和免疫組化試劑盒購自美國Santa Cruze公司),加二抗室溫30min孵育,SABC復(fù)合物室溫30min孵育,DAB染色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。每只動物均以Nomal Polyclonal IgG代替一抗設(shè)陰性對照。結(jié)果通過Metamorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng),測出血管內(nèi)皮AQP1表達(dá)的平均灰度值。

4.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以 xˉ±S表示,采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)。以 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大 鼠模型的觀察

所有實(shí)驗(yàn)動物均在觀察時間內(nèi)存活。實(shí)驗(yàn)組較鹽水對照組體重均有不同程度減輕,且體力明顯下降伴有精神萎靡。

2.肺 損傷生物學(xué)標(biāo)志

2.1 肺濕干比 (W/D)及動脈血氧分壓(PaO2)測量

實(shí)驗(yàn)組與鹽水對照組比較,W/D顯著增加伴有PaO2顯著下降,且10h達(dá)損傷高峰,24h指標(biāo)均有恢復(fù)。除6h和24h外,各組間均有顯著差異(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠肺濕/干比 (W/D)、動脈血氧分壓 (PaO2)(ˉx±s)Table 1 Lung wet/dry weight ratio and PaO2in rats(ˉx ±s)

2.2 肺組織病理改變

將各組鼠肺行 HE染色,隨著觀察時間延長,實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織損傷程度逐漸加重,6h組主要表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)增寬,輕度水腫。10h則出現(xiàn)較多巨噬細(xì)胞并伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張及充血。24h開始出現(xiàn)部分肺泡擴(kuò)張,肺泡壁斷裂融合。(見圖1)

3.A QP1免疫組化反應(yīng)染色結(jié)果

3.1 AQP1免疫組化反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕褐色表達(dá)。在正常肺組織中細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮、小血管內(nèi)皮及肺泡周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮均有AQP1表達(dá),且前兩者較后者AQP1表達(dá)明顯增強(qiáng) (P<0.05),提示AQP1在肺組織不同部位分布密度不同 (圖 2-4)。

3.2 與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮、小血管內(nèi)皮及肺泡周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮部位AQP1表達(dá)均有顯著下降,以10h組為高峰,24h組AQP1表達(dá)有所上調(diào),但AQP1在肺組織各部位免疫定位未發(fā)生改變。除6h和24h外,各組間均有顯著差異 (P<0.05)。(見表2、圖2-5)

表2 大鼠肺不同部位AQP1表達(dá)的免疫組化灰度值 (ˉx±s)Table 1 Pulmonary AQP1 gray value of immunohistochemistry in rats

討 論

金葡菌感染已成為血液、皮膚、軟組織、下呼吸道感染及ALI的重要因素[2],而且耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)所致的感染正在成為臨床治療的難題。金葡菌產(chǎn)生包括α-toxin、γ-toxin、δ-toxin及殺白細(xì)胞素等多種外毒素。以往認(rèn)為單一的毒素不會造成疾病的發(fā)生。但最近的研究表明編碼αtoxin的基因 Hla是造成金葡菌肺炎的必須因子[3,4],可見α-toxin在疾病的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位,因?yàn)樗诩?xì)胞膜上可形成親水性孔道,故又稱其為“孔形成毒素 (Pore-forming toxins)”。離體灌注的研究表明[5],肺毛細(xì)血管內(nèi)皮是α-Toxin的重要靶位。非常低劑量的α-Toxin即可致肺微血管通透性增高并形成顯著的肺水腫,而AQP1恰好主要分布在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮。Verkman等證實(shí)敲除AQP1基因的動物肺泡-毛細(xì)血管之間的水轉(zhuǎn)移速度明顯下降[6]。有研究表明病毒感染及低氧可造成肺水腫并伴有AQP1表達(dá)下降[7,8]。Landon等人的研究發(fā)現(xiàn)正常人靜脈注入大量生理鹽水后造成細(xì)支氣管旁水腫,而先天缺乏AQP1的個體未呈現(xiàn)上述的變化[9]。這些研究說明AQP1在肺水轉(zhuǎn)運(yùn)以及肺水腫的發(fā)病機(jī)理中可能起著重要的作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)給予大鼠腹腔注射α-Toxin后同樣造成了急性肺損傷的病理改變,并且以10h為炎癥高峰期 (圖1,表1)。

AQP1在肺組織的分布、表達(dá)與其功能密切相關(guān)。我們分別觀察了肺泡周圍微血管內(nèi)皮,小血管內(nèi)皮及細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮三個部位的AQP1表達(dá)情況。結(jié)果顯示AQP1主要分布于肺微血管內(nèi)皮 (LMEC),包括肺泡周圍微血管內(nèi)皮 、小血管內(nèi)皮及細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮,但分布密度不同,前者明顯低于后兩者表達(dá),而且AQP1特異表達(dá)細(xì)胞類型不受α-Toxin的影響 (圖2-4)。此外,末梢支氣管粘膜下毛細(xì)血管床具有大量的AQP1表達(dá),提示AQP1可能參與氣道濕化及氣道表面液體的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)作用 (圖4)。給予α-Toxin后肺損傷程度逐漸加重,同時AQP1在肺LMEC各部位表達(dá)明顯下降,以10h達(dá)最低,24h后AQP1表達(dá)有回升趨勢,肺水腫也有所減輕。說明AQP1可能促進(jìn)肺間質(zhì)水腫液的吸收,對機(jī)體起到積極的保護(hù)性作用[11,12]。這些數(shù)據(jù)與腺病毒感染及我們既往的內(nèi)毒素致ALI的研究結(jié)果非常類似[7,13],表明這些致病因子可能存在共同的發(fā)病機(jī)制。除了可直接造成細(xì)胞損傷外,最新研究認(rèn)為金葡菌α-toxin尚可通過多配體聚糖 (Syndecan)的機(jī)制造成肺損傷[14],但這是否有AQP1的參與尚需進(jìn)一步研究。

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圖 版 說 明

圖1 金葡菌α-Toxin作用下肺臟的病理變化 (HE染色,×400)

1a正常對照組:肺泡結(jié)構(gòu)完整。

1bα-Toxin 6h組:肺泡間隔增寬,輕度肺水腫。

1cα-Toxin 10h組:肺泡間隔增寬明顯,肺泡腔縮小,可見較多巨噬細(xì)胞及輕度肺水腫。

1dα-Toxin 24h組:肺泡壁斷裂,肺泡擴(kuò)張融合。

圖2 肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1的表達(dá) (SABC,×400)

2a正常對照組:肺泡毛細(xì)血管AQP1表達(dá)為深褐色,染色較深。

2bα-T oxin 6h組:肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色減弱。2cα-Toxin 10h組:肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色明顯減弱。

2dα-Toxin 24h組:肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色略有恢復(fù)。

圖3 肺小血管內(nèi)皮AQP1的表達(dá) (SABC,×400)3a正常對照組:小血管內(nèi)皮AQP1表達(dá)為深褐色,染色較深 (如箭頭所示)

3bα-Toxin 6h組:小血管內(nèi)皮AQP1染色減弱。

3cα-Toxin 10h組:小血管內(nèi)皮AQP1染色明顯減弱。

3dα-T oxin 24h組:小血管內(nèi)皮AQP1染色略有恢復(fù)。

圖4 細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1的表達(dá) (SABC,×400)

4a正常組:細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1表達(dá)為深褐色,染色較強(qiáng) (如箭頭所示)。

4bα-Toxin 6h組:細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色減弱。

4cα-Toxin 10h組:細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色明顯減弱。

4dα-Toxin 24h組:細(xì)支氣管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1染色略有恢復(fù)。

圖5 金葡萄α-Toxin作用下肺不同部位血管內(nèi)皮AQP1表達(dá)的變化

■肺小血管內(nèi)皮AQP1▲支氣管毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1

◆肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮AQP1

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Lung pathologic changes induced byα-Toxin of S.aureus(HE,×400)

1a Control group 1b α-Toxin 6h group

1c α-Toxin 10h group 1d α-Toxin 24h group

Fig.2 AQP1 expression in alveolar capillary endothelia(SABC,×400)

2a Control group 2b α-Toxin 6h group

2c α-Toxin 10h group 2d α-Toxin 24h group

Fig.3 AQP1 expression in pulmonary small vascular endothelia(SABC,×400)

3a Control group 3b α-Toxin 6h group

3c α-Toxin 10h group 3d α-Toxin 24h group

Fig.4 AQP1 expression in parabronchial capillary endothelium(SABC,×400)

4a Control group 4b α-Toxin 6h group

4c α-Toxin 10h group 4d α-Toxin 24h group

Fig.5 AQP1 expression in pulmonary vascular endothelia induced byα-Toxin of S.A

■AQP1 of small vascular endothelia,▲AQP1 of bronchial capillary endothelia,◆AQP1 of alveolar capillary endothelia