陳曉光， 韋藤幼， 賈守潔， 童張法

(廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004)

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習稱野葛。葛根中的葛根素具有調節(jié)血壓、增加冠脈血流量、改善腦循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化自由基等作用，臨床應用于冠心病、心絞痛均取得了明顯的療效［1］。但用于注射液中葛根素純度要求高，否則易引起發(fā)熱、過敏性皮疹、過敏性休克等癥狀［2］。目前用于葛根素純化的方法有結晶法、溶劑萃取法［3］和柱層析法［4-5］等。傳統(tǒng)的冷卻結晶［6］及超聲波結晶［7］對分離葛根素衍生物效果較差，往往需要在結晶前用酸水解法分解葛根素衍生物，并且產率都在1.5%以下。溶劑萃取法與柱層析法雖然也可得到高含量的葛根素，但需要經過反復萃取或層析，工藝較繁瑣，規(guī)模生產成本較高。

溶析法結晶法［8］操作溫度低，但是它的過飽和度不易控制，得到的晶體顆粒小，純度低。本實驗參照文獻［9］的方法，提出了改進溶析結晶法，并用其對葛根異黃酮進行提純，得到葛根素的純度達到87.8%，得率為89.3%，在純度和得率上遠遠高于傳統(tǒng)結晶法和超聲波結晶法。

1 實驗

1.1 實驗材料

葛根異黃酮，采用產自陜西省的野葛根Pueraria lobata(Willd.)Ohwi，按文獻［10］方法提取制備，經高效液相色譜檢測葛根素含量為45%。葛根素標準品(98%，購于中國藥品生物制品檢定所，批號1107522200511);甲醇(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);冰醋酸(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);甲醇，(一級色譜純，廣東汕頭市西隴化工廠)。

1.2 實驗設備

S212型恒速攪拌器(上海申順生物科技有限公司)、DDD-320型多功能電子蠕動泵(上海之信儀器有限公司)、Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷侖公司)、SK3300LH型超聲波清洗機(上?？茖С暡▋x器有限公司)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 傳統(tǒng)醋酸冷卻及超聲波結晶 稱取葛根異黃酮5.00 g，加入10倍冰醋酸，在90℃下溶解(冷卻法)或在超聲波中振蕩40 min(超聲波法)，然后轉移至室溫下冷卻1 h，過濾，真空干燥，得到初結晶葛根素，兩種方法各實驗3次。

1.3.2 改進溶析結晶 稱取葛根異黃酮15.00 g，用15 mL甲醇使其剛好完全溶解，得到的溶解液。各取一定量的冰醋酸分別做為溶析液和底物，在一定溫度及攪拌速度下，將溶解液與溶析液緩慢滴加到底物中，加入完畢后繼續(xù)攪拌2 h，過濾，洗滌，真空干燥，得到結晶葛根素。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為 ZORBAX.SB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為甲醇-水(25∶75)，流速為1.0 mL/min，室溫，檢測波長為250 nm。

1.4.2 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素對照品5 mg，定容于10 mL的量瓶中。在上述色譜條件下進樣，進樣量分別為2、4、6、8、10 μL，記錄色譜峰面積。在 2 ～10 μL 時，色譜峰面積與進樣量呈線性關系。線性回歸方程為:Y=2 054.5X －121.02，r=0.999 8，線性范圍:1 ～5 μg。

1.4.3 葛根素樣品的制備 精密稱取提純后的葛根素約16.4 mg，定容于25 mL的量瓶中。在上述色譜條件下進行分析，進樣量為6 μL，記錄色譜峰面積。

2 結果與討論

2.1 結晶條件對葛根素純度和得率的影響

2.1.1 結晶溫度 圖1為攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時間為3 h時，不同結晶溫度對葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度與得率隨著溫度的變化均存在最佳值。這是因為溫度升高，溶液黏度減小，有利于晶體的生長，但溶解度下降，結晶困難，50℃為最佳溫度。

圖1 結晶溫度對葛根素得率及純度的影響

2.1.2 攪拌速率 圖2為溫度50℃，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時間為3 h時，攪拌速率與葛根素得率和純度的關系。從圖中可以看出，開始時葛根素的純度與得率隨著攪拌速率的提高而上升，在60 r/min時達到最大值后降低。這是因為攪拌可以促進傳質，有利于維持均勻的過飽和度，可以提高葛根素的純度和得率。但是攪拌速率過大，影響了晶核的形成與晶體的生長，故純度與得率均下降。

圖2 攪拌速率對葛根素得率及純度的影響

2.1.3 底物用量 圖3為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時間為3 h時，不同底物用量對葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度隨著底物用量的增加而升高，而得率則隨著底物用量的增加而降低。這是因為隨著底物用量的增加，結晶母液的黏度降低，有利于晶體的生長，故純度增大，但隨著底物用量增大，結晶母液的溶解度變化不大，由于底物用量的加大，致使部分葛根素溶于底物，導致葛根素的得率降低。為了保證葛根素較高的收率和純度，所以最佳的底物用量為溶解液0.8倍。

2.1.4 滴加時間 圖4為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1時，不同滴加時間的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度隨滴加時間的延長而降低，得率則隨滴加時間的延長存在最佳值為4h。這是因為滴加時間短、速度快時，體系的結晶速度跟不上加料速度，導致過飽和度過大，在體系中出現(xiàn)了二次成核現(xiàn)象，雖然收率高，但葛根素晶體顆粒小、純度低;滴加時間長、速度慢時，由于過飽和度過太小，結晶速度慢，效果也差。只有控制合適的加料速度，使滴加速度與晶體生長速度同步，在一定的得率下得到的晶體純度才最高。

圖3 底物用量對葛根素得率及純度的影響

圖4 結晶時間對葛根素得率及純度的影響

2.1.5 溶解液與溶析液比例 圖5為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，滴加時間為3 h時，溶析液與溶解液用量比例對葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度與得率隨著溶析液與溶解液用量比的增大而提高，在1∶1時達到最大值后，隨著溶析液與溶解液的比例增加而降低。這是因為隨著溶析液與溶解液用量比的增大，結晶母液的過飽和度增大，葛根素結晶的成核速率與生長速率也增大，因此葛根素的純度與得率也隨之提高。但是當溶析液與溶解液用量比超過1∶1以后，結晶母液的溶解度趨近于不變，而溶析液相對過多，不僅影響了晶體的生長，而且溶解了部分葛根素，導致了得率和純度下降。

圖5 溶析液與溶解液之比對葛根素得率及純度的影響

2.2 不同結晶方法的比較

表1給出了傳統(tǒng)法、超聲波法與改進溶析法結晶在結晶時間、晶體純度與得率方面的比較。傳統(tǒng)法與超聲波法相比，在普通加熱條件下的分子運動強度相對于超聲波條件下的分子運動強度弱，有利于晶體的成長，因而加熱條件下所得的葛根素晶體純度最高。超聲波結晶屬于刺激結晶，浸膏的醋酸溶液處于超聲波條件下，促使葛根素分子驟然加速聚集，導致新相的晶核能夠迅速生成，因此超聲波結晶要比加熱結晶速度快，但是超聲波結晶是驟變的過程，影響因素頗多，在加速葛根素結晶的形成過程中，也相應加速了部分雜質在醋酸中的析出，導致了純度的下降。而改進溶析結晶法是利用了底物維持了結晶過程的過飽和度，使得葛根素在結晶過程中能夠始終保持著合適的過飽和度，這樣既保證了較高的晶體得率，又保證了較高的晶體純度，而且結晶時間也不是太長。從表中可知，改進溶析法所得到的葛根素在晶體純度和得率上都遠遠高于傳統(tǒng)法和超聲波法。

表1 不同結晶方法結果比較(n=3)

2.3 不同純化階段的液相色譜圖對照

圖6 結晶前(A)后(B)葛根素的液相譜圖的比較

圖6中，A為結晶前葛根異黃酮的液相譜圖，其中葛根素的含量為45%，3′-甲氧基葛根素含量為7.32%，還有其它雜質;B為經改進溶析法結晶后用一定濃度的醋酸洗滌干燥后葛根素的液相譜圖，經檢測葛根素含量提高到87.8%，并且3′-甲氧基葛根素、大豆苷元和其他雜質也基本被除去。

3 結論

在葛根素不同結晶方法的比較中，雖然改進溶析結晶法耗時較長，但與傳統(tǒng)法、超聲波法結晶相比，葛根素晶體的純度與得率提高了很多。改進溶析結晶法能夠有效除去3′-甲氧基葛根素、大豆苷元等葛根素衍生物，提高了葛根素的純度。

改進溶析結晶法純化葛根素的最佳工藝為:水浴溫度為50℃，攪拌速度為60 r/min，溶析液與溶解液的用量比為1∶1，底物用量為溶解液0.8倍，滴加時間為4 h條件下結晶，葛根素的純度可達到87.76%，得率為89.3%。

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