曹蘭秀， 周永學(xué)， 頓寶生， 趙 嫻

(陜西中醫(yī)學(xué)院方劑教研室，陜西咸陽712046)

女貞子(Fructus Ligustri lucidi)為木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果實，其性味甘苦、涼，入肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效［1］。有報道［2－3］，女貞子具有明顯的降脂作用，總有效率達(dá)91.2%。實驗研究［4］發(fā)現(xiàn)女貞子總黃酮(Total Flavonoid in Ligustrum Lucidum Ait，TFL)具有降低血脂，軟化血管，降血糖等作用，但女貞子降脂作用多見于臨床報道，本實驗采用Triton－WR1339誘導(dǎo)的高脂模型小鼠，觀察女貞子總黃酮的降脂作用，進(jìn)一步對其肝組織脂代謝相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，為闡釋其降脂機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與制備 女貞子總黃酮(TFL)，由陜西中醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，總黃酮含量98%，苯扎貝特(青島雙鯨制藥廠)。

1.1.2 試劑與設(shè)備 總膽固醇(TC)，甘油三脂(TG)，高密度脂蛋白(HDL－C)，低密度脂蛋白(LDL－C)試劑盒(北京中生生物高技術(shù)公司)，Triton－WR1339，焦碳酸二乙酯(DEPC)，溴化乙錠(EB)和瓊脂糖(美國sigma公司);Trizol(美國Invitrogen公司)，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒及一步法PCR試劑盒(美國Promega公司)，DNA Marker II、引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

儀器設(shè)備:TC－52/H型基因擴(kuò)增儀(Bioer)，F(xiàn)R 200A全自動紫外與可見分析裝置(上海復(fù)日科技有限公司)，DYYIII－5型水平電泳儀(上海分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 高脂模型的制備與分組 ICR小鼠(西安交大實驗動物中心)，♂性，隨機(jī)分為6組(n=10)，分正常對照組，模型組，陽性藥組(苯扎貝特100 mg/kg體重)，TFL大劑量組(300 mg/kg體重)，TFL中劑量組(150 mg/kg體重)，TFL小劑量組(75 mg/kg體重)。各組灌胃給藥3 d，正常對照組和模型組給予同體積蒸餾水。第4天，動物禁食過夜。灌胃給藥后立即對給藥組和模型組小鼠腹腔注射 Triton－WR1339(400 mg/kg體重)，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。以腹腔注射Triton－WR1339為起始時間，分別于時間點12 h和36 h連續(xù)給藥2次。在造模給藥后的第36小時眼眶采血，立即處死，取肝組織用于脂代謝因子實驗。

1.2.2 總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL－C)和低密度脂蛋白(LDL－C)水平檢測 按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 RT－PCR 檢測肝組織 PPARα，LPL 和 HMG－CoA 還原酶mRNA表達(dá)量①總RNA的提取:按照Trizol說明書操作方法操作，將提得總RNA溶解于DEPC處理的水中，測定260 nm和280 nm的紫外吸收值，檢測RNA純度，并計算RNA含量。② 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈:按M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件:70℃溫孵5 min，42℃溫孵60 min，70℃加熱10 min。③ PCR擴(kuò)增:取1 μL產(chǎn)物加入25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件:94℃5 min預(yù)變性，94℃45 s變性，55℃30 s，72℃ 1 min聚合，35個循環(huán)，72℃ 10 min延伸。引物設(shè)計:參照文獻(xiàn)方法［5］GAPDH 5′GTATGACTCCACTCACGGCAAA3′ (Forward)， 5′GGTCTCGCTCCTGGAAGATG3′(Reverse)，擴(kuò)增片段 101 bp;LPL 5′ATCGGAGAACTGCTCATGATGA3′(Forward)，5′CGGATCCTCTCGATGACGAA3′(Reverse)，擴(kuò)增片段 101 bp;PPARα 5′AGGCTGTAAGGGCTTCTTTCG3′(Forward)，5′GGCATTTGTTCCGGTTCTTC3′(Reverse)，擴(kuò)增片段 101 bp;HMGCR 5′CATGCAGATTCTGGCAGTCAGT3′(Forward)，5′CGGCTTCACAAACCACAGTCT3′(Reverse)，擴(kuò)增片段 101 bp。④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物:用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)及圖像分析軟件進(jìn)行成像及分析，結(jié)果以各樣品條帶吸收度對內(nèi)參GAPDH條帶吸收度比值表示。

1.3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)值表示為Mean±SD，數(shù)據(jù)用單因素方差分析(ANOVA)，P值小于0.05被視作具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 女貞子總黃酮對Triton誘導(dǎo)的高脂血模型小鼠TC、TG水平的影響

由表1可見，Triton誘導(dǎo)的小鼠模型血脂水平有顯著性升高，TG、TC及LDL－C濃度的顯著升高。女貞子總黃酮給藥血清TC呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

2.2 女貞子總黃酮對高脂模型小鼠肝組織LPL、PPARα、HMGCRmRNA表達(dá)水平 見表2。

凝膠電泳的結(jié)果中，GAPDH、LPL、PPARα、HMGCR 均有較明顯的條帶。以GAPDH的含量為內(nèi)標(biāo)，比較各組樣品目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)模型的LPL與PPARα的轉(zhuǎn)錄水平較正常對照有顯著下降(P＜0.05);而女貞子總黃酮則起到了較明顯的上調(diào)作用。

表1 女貞子總黃酮對高脂模型小鼠TC、TG、HDL-C，LDL-C水平的影響(±s，n=10)

表1 女貞子總黃酮對高脂模型小鼠TC、TG、HDL-C，LDL-C水平的影響(±s，n=10)

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P ＜0.01。(下同)

分 組 TC/(mg/dl) TG/(mg/dl) LDL－C/(mg/dl) HDL－C/(mg/dl)正常組128.0±12.0 167.1±23.8 98.3±20.9 69.9±8.8模型組 293.2±14.1** 243.8±14.5* 164.7±12.4* 71.7±3.5苯扎貝特100 mg/kg 86.2±12.9# 207.6±23.5 95.7±3.8# 74.2±9.2 TFL 75 mg/kg 160.8±12.9 215.7±28.0 134.6±18.3 73.5±15.5 150 mg/kg 134.1±6.4# 180.0±20.1# 123.9±28.5 85.0±8.5 300 mg/kg 126.6±3.8## 177.0±18.4# 91.6±16.4#83.6±16.4

表2 女貞子總黃酮對高脂模型小鼠肝組織LPL、PPARα、HMGCRmRNA表達(dá)水平的影響(±s，n=6)

表2 女貞子總黃酮對高脂模型小鼠肝組織LPL、PPARα、HMGCRmRNA表達(dá)水平的影響(±s，n=6)

分 組 LPL PPARαHMGCR正常組0.93±0.15 0.71±0.15 0.42±0.20模型組 0.68±0.06* 0.26±0.05* 0.86±0.24苯扎貝特100 mg/kg 0.78±0.07 0.56±0.14# 0.65±0.15 TFL 75 mg/kg 0.87±0.21 0.33±0.20 0.60±0.06 150 mg/kg 1.09±0.19# 0.34±0.06 0.61±0.03 300 mg/kg 1.31±0.33# 0.53±0.01#0.45±0.05

3 討論

腹腔注射Triton WR－1339(tyloxapol，簡稱 Triton)可造成明顯的高脂血模型。女貞子總黃酮對Triton誘導(dǎo)的高脂模型小鼠給藥后，可明顯降低 TC，TG，LDL－c，對于調(diào)節(jié)脂代謝紊亂具有明顯作用。

LPL是脂肪細(xì)胞分化的一個早期參考性標(biāo)志，是甘油三酯降解為甘油和游離脂肪酸反應(yīng)的限速酶［7］。LPL的表達(dá)受PPAR信號通路的調(diào)控［8－10］。HMGCR是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成限速酶。抑制其活性可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平減少［11］。實驗結(jié)果表明，女貞子總黃酮能顯著性增加LPL的表達(dá)，上調(diào)PPARα的表達(dá)，顯著下調(diào)HMGCR的表達(dá)。因此，女貞子總黃酮可能通過對PPARα－LPL通路以及HMGCR表達(dá)的調(diào)控來實現(xiàn)其降脂作用。

［1］樓之岑，秦 波主編.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究(北方編)第1冊［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995.497－526.

［2］張子臻.女貞子能降血脂、改善心肌供血［J］.中醫(yī)雜志，1998，39(9)，518.

［3］彭 悅.女貞子降血脂作用的臨床觀察［J］.遼寧中醫(yī)，2001，27(10)，23.

［4］盧小沅，陳志良，王春霞.女貞子化學(xué)成分及其藥理作用研究概況［J］.中藥材，2006，29(6):625－628.

［5］Huang C and Qin Y.Berberine inhibits 3T3－L1 adipocyte differentiation through the PPARγ pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348:571－578.

［6］Tedstone A E，ILIC V，and Williamson D H.Evidence that use of Triton WR1339 underestimates the triacylglycerol entry micee into the plasma of lactating mice owing to continued accumulation of lipid in the mammary gland［J］.Biochem J，1990，272:835－838.

［7］杜紀(jì)坤，黃青陽.脂蛋白脂酶基因的研究進(jìn)展［J］.遺傳，2007，29(1):8－16.

［8］Sakayama K，Masuno H，Okumura H，et al.Glycosylation of lipoprotein lipase in human subcutaneous and omental adipose tissues［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1127(2):153－156.

［9］Mead JR，Cryer A，Ramji DP.Lipoprotein lipase，a key role in atherosclerosis［J］.FEBS Lett，1999，462(1－2):1－6.

［10］Goldberg IJ.Lipoprotein lipase and lipolysis:central role in lipoprotein metabolism and atherogenesis［J］.J Lipid Res，2006，37(4):693－707.

［11］Holm C.Molecular mechanisms regulating hormone－sensitive lipase and lipolysis［J］.Biochem Soc Trans.2003，31:1120－1124.