韋桂寧， 周 軍， 蘇 青， 黃瑞松， 何 飛

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西南寧530022;2.廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西南寧530000)

菌圃多糖系昆蟲綱等翅目白蟻科動(dòng)物土垅大白蟻Macrotermes annandalei(Slivestri)蟻巢的多糖成分。蟻巢含有多種生物活性成分［1－4］，其藥用早在《本草綱目》中已有記載，在廣西壯族民間，常用于治療虛咳、虛喘等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，壯藥土垅大白蟻菌圃具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫力等作用［5－6］。菌圃多糖是蟻巢的重要生物活性成分之一，但菌圃多糖的藥理作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)菌圃多糖進(jìn)行免疫學(xué)研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用廣西壯藥資源土垅大白蟻菌圃提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

菌圃多糖，由廣西民族醫(yī)藥研究所提供:菌圃2003年4月采集于南寧市郊廣西亞熱帶作物研究所羅傘嶺水庫(kù)。

菌圃多糖的制備方法:取干燥菌圃粉碎成最粗粉，加水煎煮3次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至1∶1濃度(藥材∶藥液)，加入乙醇至醇含量達(dá)80%左右，拌勻，靜置24 h，棄去上清液，取沉淀物經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次后，加水溶解，離心，取上清液濃縮至稠膏，于80℃烘干，即得。

香菇菌多糖片，湖北廣仁藥業(yè)有限公司，批號(hào):090301;環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào):07042621。雞血紅細(xì)胞，自制。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，♂♀兼用，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證證號(hào):SCXK桂2003－0003。飼養(yǎng)于20℃ ～25℃、相對(duì)濕度(60±10)%環(huán)境中，每籠10只，顆粒飼料，自由飲水。

1.3 儀器

722型光柵分光光度計(jì)，上海分析儀器廠生產(chǎn);BS224S型電子天平，北京賽多利斯生產(chǎn);顯微鏡等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定(免疫器官重量法)［7］

取體重14～16 g昆明種小白鼠100只，♂♀各半，隨機(jī)分成10組，即免疫正常狀態(tài):菌圃多糖高、中、低3個(gè)劑量組，正常對(duì)照組，香菇菌多糖片組，免疫低下狀態(tài):環(huán)磷酰胺+菌圃多糖高、中、低3個(gè)劑量組，環(huán)磷酰胺組(免疫低下模型對(duì)照組)和環(huán)磷酰胺+香菇菌多糖片組。菌圃多糖各劑量組與香菇菌多糖片組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥10 d，劑量:菌圃多糖為107.2、53.6、26.8 mg/kg體重，香菇菌多糖片為10 mg/kg體重，正常對(duì)照組與環(huán)磷酰胺組給予等體積蒸餾水20 mL/kg。免疫抑制狀態(tài)各組在給藥同時(shí)的第7、9天皮下注射環(huán)磷酰胺各1次，每次40 mg/kg。各組末次給藥后的次日，小鼠眼眶放血處死，剝?nèi)∑⑴K、胸腺，臟器重量以(臟器重/10 g體重)表示。

2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定(腹腔巨噬細(xì)胞功能測(cè)定法)［7］

取體重18～22 g小白鼠100只，♂♀兼用，分組、給藥、劑量均與2.1項(xiàng)同。末次給藥后，每鼠腹腔注射5%(V/V)CRBC(雞血紅細(xì)胞)0.5 mL，于給CRBC后12 h，頸椎脫臼處死小鼠，剪開腹腔皮膚，腹腔注射生理鹽水2 mL，輕揉小鼠腹部后，吸取腹腔沖洗液滴片，置于墊有紗布的搪瓷盆內(nèi)，于37℃孵育30 min，孵畢，于生理鹽水中漂洗未被吞噬的CRBC 及其他細(xì)胞，吹干，固定，Giemsia－Wright染色，晾干，鏡檢觀察。按下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

2.3 小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞測(cè)定(酶標(biāo)染色法)［7］

取體重14～16 g小白鼠100只，♂♀兼用，分組、給藥方法、劑量與2.1項(xiàng)同。各組于末次給藥當(dāng)天剪去尾梢約0.2 mm，取血推片，甲醛－丙酮緩沖液固定，浸入新鮮配制的預(yù)熱3 min的孵育液中37℃孵育3 h，自來(lái)水沖洗片刻，晾干，加1%孔雀綠溶液染色8 s，自來(lái)水沖洗，晾干后油鏡檢查。每只動(dòng)物血涂片標(biāo)本均查100個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算T淋巴細(xì)胞百分比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSSl1.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差分析統(tǒng)計(jì)處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌圃多糖對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

菌圃多糖中(53.6 mg/kg)劑量組小鼠胸腺重量指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05);107.2、53.6 mg/kg劑量組對(duì)環(huán)磷酰胺引起的免疫低下小鼠胸腺重量指數(shù)顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05);對(duì)正常小鼠和免疫低下小鼠的脾重量指數(shù)無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌圃多糖對(duì)小鼠免疫器官重量的影響(±s，n=10)

表1 菌圃多糖對(duì)小鼠免疫器官重量的影響(±s，n=10)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg)脾臟重量系數(shù)/(mg/10 g)胸腺重量系數(shù)/(mg/10 g)蒸餾水 —53.66±13.46 31.66±8.48香菇菌多糖 10 59.99±8.00 39.51±6.35*菌圃多糖(低) 26.8 54.20±14.48 35.52±8.26菌圃多糖(中) 53.6 57.55±22.25 43.96±14.85*菌圃多糖(高) 107.2 55.67±16.74 32.20±13.63環(huán)磷酰胺 — 37.81±15.46** 16.93±3.90**環(huán)磷酰胺+香菇菌多糖10 43.13±9.84 25.73±6.76△△環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(低) 26.8 38.27±13.38 19.05±17.38環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(中) 53.6 41.66±6.78 22.99±5.71△環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(高) 107.2 39.37±15.96 24.33±7.32△

3.2 菌圃多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

菌圃多糖107.2、53.6 mg/kg劑量組對(duì)環(huán)磷酰胺引起的免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 菌圃多糖對(duì)小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比的影響

菌圃多糖53.6 mg/kg劑量組環(huán)磷酰胺引起的免疫低下小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比顯著高于模型對(duì)照組(P＜0.05)，對(duì)正常小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討論

多糖又稱多聚糖，由10個(gè)以上的單糖分子通過(guò)糖苷鍵聚合而成，其分子量較大，一般由幾百甚至幾萬(wàn)個(gè)單糖分子組成，是一類大分子化合物。長(zhǎng)期以來(lái)，多糖類物質(zhì)一直被視為無(wú)活性物質(zhì)，而很少被人們深入研究。隨著人們對(duì)天然植物中活性成分認(rèn)識(shí)的不斷深入，部分多糖類物質(zhì)被證明具有廣泛的生物活性及藥理作用，尤其對(duì)人體免疫系統(tǒng)的作用［8－13］，有學(xué)者將之與蛋白質(zhì)、核酸、脂類并稱為生命四大基礎(chǔ)物質(zhì)。

表2 菌圃多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s，n=10)

表2 菌圃多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(±s，n=10)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

吞噬指數(shù)蒸餾水 —組別 劑量/(mg/kg) 吞噬率/%45.00±16.87 0.98±0.25香菇菌多糖 10 59.60±12.29* 1.14±0.18菌圃多糖(低) 26.8 44.20±12.30 0.92±0.26菌圃多糖(中) 53.6 46.90±14.50 0.96±0.26菌圃多糖(高) 107.2 47.30±13.36 0.97±0.30環(huán)磷酰胺 — 21.00±14.90** 0.39±0.30**環(huán)磷酰胺+香菇菌多糖10 42.2±13.5△△ 0.83±0.29△△環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(低) 26.8 29.8±8.9 0.61±0.17環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(中) 53.6 34.60±11.69△ 0.79±0.24△△環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(高) 107.2 38.00±10.72△△ 0.89±0.20△△

表3 菌圃多糖對(duì)小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比的影響(±s，n=10)

表3 菌圃多糖對(duì)小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比的影響(±s，n=10)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別 劑量/(mg/kg)外周血中T細(xì)胞百分比/%蒸餾水 —54.75±16.02香菇菌多糖 10 67.40±9.28*菌圃多糖(低) 26.8 52.80±9.31菌圃多糖(中) 53.6 55.80±11.05菌圃多糖(高) 107.2 57.10±11.30環(huán)磷酰胺 — 30.38±12.21**環(huán)磷酰胺+香菇菌多糖 10 44.13±12.95△環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(低) 26.8 33.20±9.12) 53.6 45.00±13.60△)107.2 31.40±8.00環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(中環(huán)磷酰胺+菌圃多糖(高

菌圃多糖是土垅大白蟻菌圃主要活性成分之一，具有重要的生物活性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌圃多糖可顯著增加正常小鼠和免疫低下小鼠胸腺指數(shù)，顯著提高環(huán)磷酰胺引起的免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，顯著提高環(huán)磷酰胺引起的免疫低下小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞百分比，提示菌圃多糖可以通過(guò)影響非特異性免疫和細(xì)胞免疫等途徑調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能。說(shuō)明菌圃多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制是復(fù)雜的，可對(duì)免疫系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)、多個(gè)靶點(diǎn)起作用，這和已經(jīng)報(bào)道的活性多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能有相同之處。

研究表明，活性多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)與淋巴細(xì)胞表面特異受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。和酶一樣，活性多糖分子中存在一個(gè)或幾個(gè)寡糖片段的活性中心，能特異識(shí)別和結(jié)合免疫細(xì)胞上的特異受體，通過(guò)影響基因表達(dá)、淋巴細(xì)胞信息傳導(dǎo)(鈣離子傳導(dǎo)，對(duì)cAMP、cGMP、NO、前列腺素的影響)表現(xiàn)其生物學(xué)功能。菌圃多糖對(duì)免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，其生理活性可能與多糖分子量和分子量分布及化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，及其對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的分子生物學(xué)機(jī)制等，均有待進(jìn)一步深入研究。

［1］黃瑞松，梁?jiǎn)⒊?，莢建光，等.不同時(shí)間采集壯藥土垅大白蟻菌圃指紋圖譜的研究［J］.中草藥，2006，37(3):439－441.

［2］薛德鈞，周 慧，張 敏，等.白蟻菌圃的水溶性化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2005，28(10):873－875.

［3］張會(huì)明，薛德鈞.HPLC法對(duì)黑翅土白蟻菌圃中抗炎活性成分的研究［J］. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，19(6):34－36.

［4］Peppuy A，Robert A，Semon E，et al.(Z)－dodec－3－en－1－ol，a novel termite trail pheromone identified after solid phase microextraction from Macrotermes annandalei［J］.J Insect Physiol.2001，47(4－5):445－53.

［5］黃瑞松，葉琦莉，陳超樹，等.壯藥土垅大白蟻菌圃水提醇溶物對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2005，12(6):382－383.

［6］曹 娟，孫 濤，張 敏.白蟻菌圃的抗炎作用研究［J］.中藥材，2006，29(10):1011－1013.

［7］李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:721，723，727.

［8］仰榴青，茆廣華，吳向陽(yáng)，等.銀杏外種皮多糖的免疫活性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(4):872－873.

［9］戴 慧，高曉明.多糖特異性免疫識(shí)別的分子機(jī)制及其免疫生物學(xué)意義［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，29(1):35－39.

［10］Graff JC，Kimmel EM，F(xiàn)reedman B，et，al.Polysaccharides derived from Yamoa(Funtumia e lastica)prime gammadelta T cells in vitro and enhance innate immune responses in vivo［J］.Int Immunopharmacol，2009，9(11):1313－1322.

［11］Baumgart DC，Thomas S，Przesdzing I，et al.Exaggerated inflammatory response of primary human myeloid dendritic cells to lipopolysaccharide in patients with inflammatory bowel disease［J］.Clin Exp Immuno，2009，157(3):423－436.

［12］薛 明，田麗娟.青蒿多糖的免疫活性研究［J］.中成藥，2008，30(8):1211－1213.

［13］陳俊威，徐旭東.紅栓菌胞外多糖抗腫瘤及免疫藥理作用［J］. 中成藥，2005，27(10):1217－1218.