張靜澤， 高文遠(yuǎn)*， 王 磊，2， 馬超一

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072;2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠，天津300380)

中藥胃腸安丸是由木香、沉香、枳殼(麩炒)、檀香、大黃、厚樸(姜制)、朱砂、麝香、巴豆霜、大棗(去核)、川芎等十一味中藥組成［1］，其中君藥:木香、沉香、檀香;臣藥:厚樸、枳殼、川芎;佐使藥:大黃、巴豆霜、麝香、大棗、朱砂。此方對(duì)于治療各種感染性、非感染性腹瀉以及胃腸功能性障礙所造成的惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、腹瀉等癥狀效果顯著，并能改善胃腸功能;具有解痙、止瀉等作用。2005版中國(guó)藥典中只是以厚樸中的厚樸酚及和厚樸酚作為質(zhì)量控制的指標(biāo)，凌寧生等又對(duì)其中柚皮苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)測(cè)定10個(gè)批次胃腸安丸樣品發(fā)現(xiàn)其中柚皮苷含量不少于4.38 mg/g［2］。胃腸安丸組方獨(dú)特，止瀉不留邪，具有通因通用的特點(diǎn)，臨床用于治療腹瀉的效果顯著，能夠明顯緩解現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中腹瀉型腸易激綜合癥的各種癥狀;同時(shí)胃腸安丸方對(duì)于胃腸道功能具有雙向調(diào)節(jié)的作用，藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明胃腸安丸甲醇提取物能夠使正常小鼠的小腸推進(jìn)率增加，使新斯的明致瀉小鼠的小腸推進(jìn)率明顯降低［3］。因此，對(duì)于便秘型腸易激綜合癥的患者也有一定的治療作用。方中大黃的蒽醌類成分對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用，而對(duì)于方中具有瀉下活性的大黃中蒽醌類成分的含量尚無(wú)報(bào)道，由于中藥胃腸安丸對(duì)胃腸道功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，因此本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法對(duì)于胃腸安丸中所含的大黃蒽醌進(jìn)行含量測(cè)定，一方面能夠?yàn)楸ＷC胃腸安丸用藥的安全有效提供了重要的數(shù)據(jù)支持，另一方面也為深入探討大黃作為佐使藥在方中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 樣品與試劑 胃腸安丸由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)為:WCAWD109002、D109004、D10909、D109010、D109020。對(duì)照品:蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):110756-200310、0757-200206、110756-200110、1107996-200310、1107580-200409)。乙腈、甲醇為色譜純、冰醋酸、氯仿為分析純(天津康科德醫(yī)藥化工有限公司)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Waters2414型高效液相色譜儀;Waters2998紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器);微量分析天平(CP225D，Sartourius Co.);Kromasil色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);微量進(jìn)樣器(25 μL，Hamilton)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相:A:甲醇，B:0.5%醋酸水溶液，梯度洗脫:0～20 min，A為65% ～85%;柱溫:35℃;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。理論塔板數(shù):各對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰理論塔板數(shù)不小于4 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得到蘆薈大黃素60 μg/mL、大黃酸90 μg/mL、大黃素100 μg/mL、大黃酚140 μg/mL、大黃素甲醚30 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取各對(duì)照品溶液2 mL混合均勻定容至10 mL，作為混合對(duì)照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定胃腸安丸粉末約1.0 g，置50 mL具塞三角瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，置于燒瓶中，揮去溶劑，加8%HCl溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，加少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际怪芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得，微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。另取處方藥材(缺大黃陰性)按照上述方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液4、8、12、16、20 μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，分別記錄峰面積。以大黃5種蒽醌進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，所得線性回歸方程分別為:蘆薈大黃素:Y=11 645X－22 533，r=0.999 8;大黃酸:Y=61 823X －18 028，r=0.999 9;大黃素:Y=82 864X+24 062，r=0.999 8;大黃酚:Y=11 911X －25 010，r=0.999 8;大黃素甲醚:Y=71 408X －5 671，r=0.999 9。

線性范圍分別為:蘆薈大黃素3.29～16.44 μg/mL;大黃酸9.08 ～45.40 μg/mL;大黃素 13.92～69.60 μg/mL;大黃酚14.60 ～73.00 μg/mL;大黃素甲醚2.91～14.55 μg/mL，在此范圍內(nèi)樣品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下色譜條件，取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，依法測(cè)定，記錄分析樣品中大黃蒽醌各組分峰面積值，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為0.72%、0.82%、0.72%、0.91%、1.03%(n=6)，結(jié)果表明該儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的胃腸安丸樣品按照供試品溶液的制備方法配制溶液，分別精密稱取5份，按2.1項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，記錄分析樣品中大黃蒽醌各組分峰面積值，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為1.45%、0.81%、0.76%、1.33%、1.29%(n=5)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的胃腸安丸樣品按照供試品溶液的制備方法配制溶液，避光室溫放置，在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣20 μL，按照2.1 項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，記錄與混合對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的各峰峰面積，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚 RSD分別為 0.98%、0.87%、1.00%、0.85%、1.24%，所得結(jié)果的RSD值均小于2%，表明供試樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批胃腸安樣品約1.0 g，共6份，分別置上述具塞三角瓶中，精密吸取一定量混合蒽醌對(duì)照品溶液，混合均勻，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 胃腸安丸中5種蒽醌類化合物加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 The recovery test results of 5 kinds of anthraquinones in Weichang’an Pill

2.9 空白試驗(yàn) 除大黃外按處方量稱取其他藥味，按處方工藝制成不含大黃的制劑，制成缺大黃的陰性空白對(duì)照液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，記錄各峰峰面積。對(duì)照品、空白對(duì)照和供試品的HPLC圖見(jiàn)圖1，由此證明其他藥材中的所含的成分在此檢測(cè)條件下并不影響大黃蒽醌的測(cè)定。

2.10 樣品測(cè)定 取5批胃腸安丸，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，每批制備3份。精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，按照5種蒽醌的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)5批胃腸安丸中蒽醌類成分進(jìn)行檢測(cè)，胃腸安丸中5種蒽醌的總量不少于為1.03 mg/g。

3 討論

胃腸安丸由十一味中藥組成，其君藥中木香的主要活性成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯具有松弛平滑肌和解痙的作用，能夠明顯抑制小鼠腸蠕動(dòng)［4］;臣藥厚樸中主要活性成分厚樸酚對(duì)豚鼠末段結(jié)腸的推進(jìn)具有明顯抑制作用，提示其具有止瀉作用，為中藥厚樸治療下消化道疾病的藥理學(xué)基礎(chǔ)之一;小腸炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)也證明厚樸酚能明顯抑制小腸炭末推進(jìn)率，說(shuō)明其對(duì)小鼠的小腸運(yùn)動(dòng)具有抑制作用;還能明顯減少番瀉葉與蓖麻油引起的小鼠濕糞增加，說(shuō)明其對(duì)番瀉葉引起的腸道蠕動(dòng)與分泌增加有明顯抑制作用，對(duì)蓖麻油水解成蓖麻酸后引起水和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生改變的過(guò)分泌反應(yīng)有抑制作用，認(rèn)為是胃腸安發(fā)揮止瀉作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［5］。然而對(duì)于方中具有瀉下活性的大黃中蒽醌類成分的含量尚無(wú)報(bào)道，由于胃腸安對(duì)于胃腸道功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，因此對(duì)于具有瀉下活性的大黃蒽醌含量進(jìn)行測(cè)定對(duì)于評(píng)價(jià)胃腸安丸的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。

圖1 胃腸安丸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard solution(A)，Weichang’an Pill sample solution(B)and negative sample(C)A.混合對(duì)照品 B.胃腸安供試品 C.陰性樣品

表2 不同批次樣品中5種蒽醌的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Contents of 5 kinds of anthraquinones in different samples(n=3)

胃腸安丸藥味多，所含化合物種類繁多，在選擇流動(dòng)相比例時(shí)，考察了乙腈－0.5%醋酸水溶液，甲醇－0.5%醋酸水溶液等度與梯度條件下樣品分離效果，在乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，調(diào)整流動(dòng)相比例很難在短時(shí)間內(nèi)將蘆薈大黃素和大黃酸的兩個(gè)色譜峰分開(kāi)。多數(shù)對(duì)于復(fù)方中大黃蒽醌HPLC測(cè)定的色譜條件是采用甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15)［6］，然而在對(duì)胃腸安丸進(jìn)行測(cè)定時(shí)等度條件下分離效果不理想，因此采用甲醇－0.5%醋酸水溶液梯度洗脫分離效果良好，而且分析時(shí)間短，測(cè)定能夠在30 min內(nèi)完成。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定胃腸安丸中蒽醌類成分的含量。

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