呂美紅， 嚴啟新， 梁 慧， 李 勇， 馮漢林， 謝曉梅

(1.安徽中醫(yī)學院藥學院，安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽合肥230031;2.深圳海王生物工程股份有限公司，廣東 深圳518057)

蒼術(Rhizoma Atractylodis)為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術 Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，性溫，味辛、苦，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾，祛風散寒，明目之功效［1］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蒼術具有抗炎抗菌［2］、降糖、利尿、抗?jié)?、促進胃排空、調(diào)節(jié)腸免疫功能［3］、抗心率失常及心肌保護［4］等作用，與大多數(shù)中藥材一樣，其藥理活性復雜，藥效不是來自任何單一活性成分。蒼術中的主要成分為揮發(fā)油和苷類成分。傳統(tǒng)中藥質量評價方法是對某一化學成分進行定性或定量分析，而對大多數(shù)中藥來說，任何單一活性成分或指標成分都難以全面準確地評價中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，因此，本實驗采用GC法建立蒼術的指紋圖譜，在14批樣品測定的基礎上，初步總結出不同產(chǎn)地蒼術指紋圖譜的共性，為其質量控制標準的建立提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent6890 N氣相色譜儀 (美國Agilent公司);氫火焰離子化檢測器;AG135型電子天平(METTLER TOLEDO);KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);正十五醇 (Sigma－Aldrich Traning Co.，Ltd，純度為99%);乙酸乙酯(色譜純);水為重蒸水;其它試劑均為分析純;蒼術藥材與飲片來自江蘇、湖北、吉林、內(nèi)蒙、陜西、安徽等地，2008年或2009年收集，均經(jīng)安徽中醫(yī)學院藥學院中藥教研室彭華勝副教授鑒定，樣品來源見表1。

表1 蒼術樣品的來源Tab 1 Sources of Rhizoma Atractylodis samples collected

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:HP－INNOWax Polyethylene Glycol(30.0 m×0.32 mm×0.5 μm)石英毛細管柱，氫火焰離子化檢測器，氣化室溫度:270℃，柱溫:185℃，檢測器溫度:280℃，載氣為氮氣，流速:25 mL/min，空氣流速:380 mL/min，氫氣流速:40 mL/min，柱前壓為4.14×104Pa。

2.2 參照物溶液的制備 采用正十五醇(內(nèi)標)為參照物，精密稱定0.40 g，置1 000 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解，并稀釋至刻度，作為參照物溶液(每1 mL中約含正十五醇0.40 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取蒼術過2號篩藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯25 mL，40℃超聲(功率300 W，頻率40 kHz)提取15 min，過濾，濾渣再加乙酸乙酯25 mL，同法處理，合并兩次濾液，蒸干，殘渣用上述參照物溶液溶解并定量轉移至25 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜即得供試品溶液。

2.4 測定方法 分別將各批藥材與飲片的供試品溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 空白試驗 取乙酸乙酯注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 空白試驗色譜圖Fig.1 GC chromatograms of blank solution

2.5.2 對照試驗 取參照物溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖2。

圖2 對照試驗色譜圖Fig.2 GC chromatograms of control solution

2.5.3 精密度試驗 取同一供試品溶液(樣品編號12)，連續(xù)進樣6次，測得各共有峰相對峰面積的RSD小于2.89%，相對保留時間的RSD小于1.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取供試品(樣品編號12)過2號篩粉末約0.5 g，精密稱定，按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，測得各共有峰相對峰面積的 RSD小于2.96%，相對保留時間的RSD小于0.86%，表明實驗重復性良好。

圖3 蒼術氣相指紋圖譜Fig.3 The GC fingerprinting of Rhizoma Atractylodis

2.7 指紋圖譜的分析與評價

2.7.1 共有指紋峰的標定 將參照物峰保留時間作為1，計算其它各共有峰與參照物峰間保留時間的比值，從而得出各共有峰的相對保留時間，結果見表2。通過比較14批蒼術樣品色譜圖和相對保留時間，發(fā)現(xiàn)其中10個峰是各批供試品所共有，保留時間相對穩(wěn)定，因此確定這10個峰為共有指紋

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(樣品編號12)，分別于 0、2、4、8、12、24 h 時間點進樣分析，測得各共有峰相對峰面積基本一致，RSD小于1.98%，相對保留時間的RSD小于0.78%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的要求。

圖4 不同產(chǎn)地蒼術氣相指紋圖譜Fig.4 The GC fingerprinting of Rhizoma Atractylodis from different habitats

2.6 指紋圖譜的建立 取供試品溶液適量注入氣相色譜儀，在同一選定的色譜條件下檢測14批樣品。蒼術指紋圖譜與不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜見圖3～4。峰。并通過對照，峰S為參照物正十五醇的峰，其保留時間為26.8 min，7、8號共有峰分別為茅術醇與 β－桉葉醇，其保留時間分別為22.1、24.9 min。且此兩峰在各批樣品指紋圖譜中峰高較高，面積較大，含量較高，為主成分峰，因此在各批樣品中較易被檢出，可作為含量測定時的指標成分。

表2 14批蒼術共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention times of common peaks for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

2.7.2 共有指紋峰面積的分析 將參照物峰面積作為1，計算其它各共有峰與參照物峰間的面積比，從而得出各共有峰的相對峰面積，結果見表3。通過比較蒼術各批樣品指紋圖譜中共有峰的峰面積，可知各共有峰相對峰面積差異較大，表明不同產(chǎn)地的蒼術藥材與飲片中共有成分的含量存在顯著差異，14號樣品(陜西)的兩主成分色譜峰7、8的峰面積最大，同時即使是同一產(chǎn)地，如樣品1～4號，其產(chǎn)地相同，但其含量仍存在顯著差異，樣品10與11號也是如此，但在各批藥材指紋圖譜中，各共有峰的面積之和大于總體峰面積的90%。2.7.3 非共有峰的分析 本實驗所測定的14批藥材與飲片中，除上述10個共有峰外，各自指紋圖譜中還存在非共有峰，總體上來看，各批樣品中非共有峰所占面積比例較小，不過10%，而且各自非共有峰的峰數(shù)也各不相同，這表明各批樣品由于產(chǎn)地、生長環(huán)境等不同，在成分組成上除上述主要共有成分外，還是存在一定差異，其中4號樣品非共有峰數(shù)目最少，14號樣品非共有峰數(shù)目最多，表明4號樣品成分組成最為簡單，14號樣品成分組成最為復雜;2號樣品非共有峰所占面積比最大，12號樣品非共有峰所占面積比最小，表明2號樣品非共有成分含量所占比例最高，12號樣品非共有成分含量所占比例最低。14批樣品峰總數(shù)與非共有峰所占面積比見表4。

表3 14批蒼術共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak area of common peaks for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

表4 14批蒼術非共有峰面積比Tab 4 Peaks area ratio of non-common for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

2.7.4 相似度評價 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”(藥典委員會)，以12號湖北產(chǎn)蒼術樣品色譜圖作為參照圖譜進行相似度計算，結果14批蒼術藥材與飲片中，相似度值在0.992～0.688間，大部分樣品相似度較高，但仍不能直接建立蒼術指紋圖譜的共有模式，需對蒼術各藥材與飲片進行進一步樣品間差異的評價，進行圖譜模式識別分類，以便最終能夠建立真實可靠的蒼術標準指紋圖譜。

3 討論

3.1 參照物溶液的制備 本實驗選用了從正十一醇至正十五醇以及它們所對應的烷烴等作為參照物進行試驗，最終確定采用以正十五醇為參照物，其保留時間約為26.8 min，與樣品各峰互不干擾，峰位穩(wěn)定，分離度符合要求，基線平穩(wěn)，重復性也好。

3.2 色譜柱的選擇 本實驗試用了HP－INNOWax Polyethylene Glycol(30.0 m ×0.32 mm × 0.5 μm)、HP－5(30.0 m ×0.32 mm ×0.25 μm)等石英毛細管柱，最終在 HP－INNOWax Polyethy－lene Glycol(30.0 m ×0.32 mm ×0.5 μm)柱上各批樣品供試液均能得到較好分離，出峰時間穩(wěn)定適中，且峰數(shù)較多，故本實驗選用此柱。

3.3 指紋圖譜的建立意義 本實驗初步建立了蒼術的指紋圖譜，在有限樣本的測定基礎上，共找出了10個共有峰，并指認了其中兩個含量較高的成分峰——茅術醇與β－桉葉醇，所得的指紋圖譜多個成分間分離效果良好，能夠較全面地反應蒼術藥材與飲片的內(nèi)在質量，符合中藥質量控制的整體性、復雜性和全面性的要求，為控制蒼術內(nèi)在質量提供了依據(jù)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:111.

［2］肖 洋，張凌贏，華 芳，等.蒼術提取液對銅綠假單胞菌R質粒體內(nèi)體外消除作用的實驗研究［J］.中國老年學雜志，2002，22:216.

［3］Yu K W，Kiyohara H，Matsumoto T，et al.Structural characterization of intestinal immune system modulating new arabino－3，6－galactan from rhizomes of Atractylodes lancea DC ［J］.Carbohydr Polym，2001，46:147.

［4］朱惠京，張紅英，馬玉蓮，等.關蒼術正丁醇萃取物對大鼠心肌缺血及缺血－再灌注損傷的保護作用［J］.中國中醫(yī)藥科技，2000，7(3):173.